赭曲霉毒素A金标免疫斑点检测方法的研究

摘要

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）是由曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌产生的次级代谢产物，它是食品和饲料中的主要污染物之一，经常出现在各种各样的食物中，包括谷类、咖啡、葡萄等。其毒性作用主要包括肾毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸作用、致癌作用等，因而，大部分国家均规定了OTA的限量标准。目前，OTA的检测主要有仪器学方法和免疫学方法，而免疫学方法以其独特的优点得到了广泛的应用。
　　金标免疫斑点法（Dot Immunogold Filtration Assay，DIGFA）是免疫学检测方法的一种，它以快速、简便、成本低、不需专业技术人员等优点成为研究、应用的热门。
　　由于OTA是一种半抗原，本研究采用活性酯法合成OTA完全抗原，并将完全抗原进行紫外可见光谱扫描，确证完全抗原合成成功。使用OTA-BSA完全抗原免疫试验用动物，对得到的抗血清使用酶联免疫吸附法（ Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）进行检测，得到了高灵敏度及高特异性的抗 OTA多克隆抗体。随后，对此多克隆抗体进行纯化，建立了检测OTA的DIGFA，并使用了DIGFA对实际样品进行检测，具体内容如下。
　　1抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备
　　OTA是一种小分子抗原，分子量仅为403.8，没有免疫原性，只有反应原性，故称为半抗原。这种半抗原需要与大分子物质（如蛋白质等）偶联形成完全抗原，才能刺激机体产生抗体。本研究依据OTA含有的典型羧基，采用活性酯法使OTA与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）偶联，形成OTA-BSA免疫抗原与OTA-OVA包被抗原。然后，通过紫外可见光谱对这两种完全抗原进行分析，完全抗原中OTA的特征吸收峰从333 nm红移到380 nm，这是由于在蛋白质的作用下， OTA中酚羟基的解离程度发生改变，从而导致吸收峰发生红移。另外，完全抗原中的蛋白吸收峰较OTA也有显著升高，这些都间接表明完全抗原构建成功。
　　使用制备好的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，45μg/只/次，免疫周期为4周，3周，3周。三只小鼠在二免后均对 OTA产生免疫应答，不同小鼠应答程度不同，但总体相差不大。三只小鼠效价均在105以上。从抗体竞争抑制曲线可知，三免后，1＃小鼠灵敏度约5 ng/mL，2＃小鼠约为8 ng/mL，3＃小鼠约为50 ng/mL。
　　对试验兔子使用免疫抗原OTA-BSA进行免疫，200μg/次/只，免疫周期为1个月，从抗体产生曲线可知，两只兔子均对OTA产生免疫应答，其效价均在105以上。三免后，1＃兔灵敏度约达到了8 ng/mL，2＃兔子灵敏度约达到了20 ng/mL。通过对抗血清进行特异性检测，可以看出，抗OTA血清与ZEN、AFB1、CIT均无交叉反应，特异性较好，可满足实际检测需求。且拿到1＃与2＃兔抗血清各60 mL左右，其量完全可用于后续试验。
　　2金标免疫斑点法检测OTA的研究
　　本章建立了检测OTA的DIGFA法，在确定了胶体金标记的最佳pH值及最佳包被量后，将纯化后的抗 OTA抗体标记到胶体金上，得到胶体金探针。对胶体金探针进行质量鉴定表明，抗OTA抗体标记到胶体金上，且质量较好，可用于后续试验。
　　在间接竞争ELISA基础上，以OTA-OVA作为包被抗原，抗OTA的金标探针为分析探针，初步建立了检测 OTA的 DIGFA法。通过对该法的灵敏度检测，得到的 OTA的检测限为10 ng/mL。且该方法对AFB1、ZEN、CIT的特异性较好，无交叉反应，可初步用于检测实际样品。
　　3金标免疫斑点法在实际样品检测中的应用
　　采用第三章建立的DIGFA法对加标回收样品及9种常见农产品进行检测，加标回收中0和10 ng/mL的加标样品有红色斑点出现，20，30，40 ng/mL的加标样品无红色斑点出现，而9种农产品均有红色斑点出现，结果均为阴性。
　　使用ELISA法检测加标回收样品与实际样品，以1＃兔血清作为检测血清，在1-100 ng/mL的线性范围内，建立了ELISA标准曲线。在ELISA标准曲线基础上，加标OTA的平均回收率在67％-88.13%之间，变异系数均在5.57%-12%之间。对9种常见农产品进行检测后，检测结果均为阴性。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1. 赭曲霉毒素A

1.1 赭曲霉毒素A的理化性质

1.2 赭曲霉毒素A的危害

1.3 赭曲霉毒素A的限量标准

2. 赭曲霉毒素A的检测方法

2.1 薄层层析色谱法

2.2 高效液相色谱法

2.3 酶联免疫吸附法

2.4 金标免疫层析法

3. 金标免疫斑点法

3.1 金标免疫斑点法的原理

3.2 金标免疫斑点法的建立

3.3 金标免疫斑点法的应用

4. 本研究的目的意义和内容

4.1 目的和意义

4.2 研究内容

第二章 抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

1. 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 主要材料

1.4 ELISA主要试剂的配制

2. 方法

2.1 OTA-BSA完全抗原的制备

2.2 OTA-OVA完全抗原的制备

2.3 紫外-可见光谱分析

2.4 动物饲养及免疫

2.5 抗血清制备及分析

3. 结果与分析

3.1 OTA-BSA(OVA)的制备

3.2 完全抗原的紫外-可见光谱分析

3.3 抗血清特性分析

4. 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第三章 金标免疫斑点法检测OTA的研究

1. 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 主要溶液的配制

2. 方法

2.1 胶体金溶液的制备

2.2 抗OTA抗体的纯化

2.3 胶体金探针的制备

2.4 胶体金探针的质量鉴定

2.5 金标免疫斑点法（DIGFA）的建立

2.6 灵敏度检测

2.7 特异性检测

3. 结果与分析

3.1 胶体金溶液的制备

3.2 抗OTA抗体的纯化

3.3胶体金探针的制备

3.4 胶体金探针的质量鉴定

3.5 金标免疫斑点法（DIGFA）的建立

3.6 灵敏度检测

3.7 特异性检测

4. 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第四章 DIGFA在实际样品检测中的应用

1. 材料

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

1.3 主要材料

2. 方法

2.1 OTA加标液的制备

2.2 OTA样品提取液的制备

2.3 DIGFA检测实际样品

2.4 ELISA法检测实际样品

3. 结果与分析

3.1 DIGFA法检测实际样品

3.2 ELISA法检测实际样品

4. 小结与讨论

4.1 小结

4.2 讨论

第五章 结论与展望

1. 结论

1.1 抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

1.2 金标免疫斑点法检测OTA的研究

1.3 DIGFA在实际样品检测中的应用

2. 展望

2.1 完全抗原鉴定方面

2.2 DIGFA检测方面

2.3 试剂盒方面

2.4 单克隆抗体方面

参考文献

致谢