T-2毒素影响K562细胞向红系细胞分化相关的基因组和蛋白组研究

摘要

T-2毒素是由镰刀菌等霉菌产生的单端孢霉烯族A类毒素。T-2毒素广泛存在于自然界，是一类常见的引起全球性谷物粮食污染性霉菌毒素之一。该毒素是单端孢霉烯族毒素中急性毒性最强的一种，严重危害人畜健康。动物食入这种霉变的粮食则会引起拒食、呕吐、白细胞减少、造血系统萎缩及各种免疫抑制反应，抑制蛋白质合成，从而引起致癌性等毒性反应。动物实验研究发现，T-2毒素的主要靶器官之一是动物的造血系统，可引起动物骨髓和脾脏等造血器官损伤，使动物造血系统中多能造血干细胞(CFUs)，粒系祖细胞(CFU-GM)，分化后红系祖细胞(CFU-E)，分化前红系祖细胞(BFU-E)等明显减少，红细胞和血小板计数下降，贫血等。然而，早期对单端孢霉烯族毒素对造血系统损伤的研究并不深入，T-2毒素影响造血干细胞分化的分子机制及信号通路研究还不清楚。鉴于T-2毒素造血系统毒性的重要性，我们选择处于多能造血干细胞状态的人红白血病K562细胞为研究对象，利用目前比较先进的基因芯片技术和双向凝胶电泳技术，通过分析T-2毒素对造血干细胞分化毒性相关的差异基因组和差异蛋白质组，探讨T-2毒素影响造血干细胞分化为红系细胞的分子机理，深入揭示T-2毒素血液系统毒性的机制，为其解毒提供理论依据。
　　 本研究采用MTT法检测T-2毒素(5～50 nM)对K562细胞株分别作用24～72 h后细胞活力的影响，并检测T-2毒素(5～50 nM)对K562细胞作用48 h后细胞LDH释放率，发现T-2毒素能够显著抑制K562细胞活力，表现出显著的时间、剂量依赖性的毒性效应。
　　 通过流式细胞术检测特异性结合CD235a-FITC抗体的红系分化K562细胞数目，确定T-2毒素对K562细胞红系分化的细胞毒性。发现阴性对照丁酸钠处理K562细胞后，随孵育时间延长，细胞向红系分化的数目显著增加，且48 h诱导细胞红系分化最显著，为空白对照组的5.36±0.59倍。低浓度T-2毒素(5 nM)处理细胞后，同样可以促进K562细胞向红系细胞分化；高浓度T-2毒素(50 nM)处理细胞后，则表现为显著抑制K562细胞的红系分化，48 h抑制作用最显著，为0.23±0.03倍。在5～50 nM T-2毒素处理细胞48 h后，在T-2毒素浓度为15 nM时出现显著抑制K562细胞分化作用。因此，在后续实验中选择48 h作为药物作用的最佳时间，15 nM为毒素作用剂量。
　　 将荧光探针DCFH-DA加入与15 nM T-2毒素共孵育2h、4h、8h、12 h后的K562细胞中，用流式细胞仪检测标记荧光探针的细胞，确定T-2毒素作用下细胞内ROS的释放量。结果显示，T-2毒素可以引起K562细胞内ROS释放呈现时间依赖性变化。T-2毒素在作用细胞4h时ROS释放量最高，达到2.25±0.10倍，随着T-2作用时间延长，ROS释放量逐渐降低，恢复到正常水平。
　　 用15 nM T-2毒素，0.6 mM丁酸钠和1 mM过氧化氢分别与K562细胞孵育48 h，用基因表达谱芯片检测三种药物对K562细胞mRNA表达量改变。结果显示，与空白对照组相比，T-2毒素组有1670个差异基因，其中上调的有653个(已知名称和功能的基因有583个)，下调的有1017个(已知基因有398个)；丁酸钠处理组有317个差异基因(已知基因占170个)，过氧化氢处理组有282个差异基因(已知基因占116个)。T-2毒素组与丁酸钠组相比较有67个共同作用上调基因，56个共同的下调基因；T-2毒素组与过氧化氢组相比较有25个共同上调基因，167个共同的下调基因。将这些差异基因按生物学进程共分为9类：核酸转录调控、物质代谢、能量代谢、细胞进程、造血相关、细胞转运、细胞形态、细胞内信号转导、细胞应激反应。分析相关基因功能，我们推断转铁蛋白(TF)及血红素合成可能是T-2毒素的抑制造血细胞分化毒性的重要分子靶点；大量与细胞周期相关基因出现差异性表达，如cyclin B2、cyclinG1、cyclin G2、CDK2、ATM、cyclin D1等。另外，在流式细胞术测定毒素对K562细胞周期影响，结果显示高浓度T-2毒素(15 nM)可以引起细胞阻滞在S期，细胞周期阻滞使细胞增殖停止，造血祖细胞数目减少也会影响其分化数目，造成外周血液系统中各系血细胞数目降低；T-2毒素能诱导代谢相关基因差异表达，干扰K562细胞内正常的物质和能量代谢，造成细胞增殖与分化所需能量和物质不足，导致K562细胞红系分化能力降低，产生造血系统毒性作用；T-2毒素影响MAPK信号转导通路和JAK-STAT信号通路激活，抑制K562细胞向红系分化。RT-PCR确证基因芯片结果可靠，目的基因差异表达趋势相同，但是RT-PCR灵敏性高于基因芯片。
　　 双向凝胶电泳技术(2-DE)和飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)分析发现，与空白组细胞相比，T-2毒素作用后K562细胞共鉴定分析出22种差异蛋白质，包括七类：基因修饰和修复蛋白，细胞转运蛋白，细胞凋亡相关蛋白，分子伴侣，信号通路激酶因子，细胞内物质氧化还原蛋白以及细胞内物质和能量代谢相关蛋白。多个能量代谢中比较重要的酶类表达水平改变，如柠檬酸合酶、NADPH脱氢酶和葡萄糖苷酶，提示T-2毒素影响了K562细胞内正常的能量和物质代谢过程。另外，DNA结合蛋白B、膜联蛋白A1、细胞凋亡相关蛋白、蛋白酶激活因子、过氧化物氧还酶4、硫氧还蛋白依赖的氧化还原酶等其他蛋白质在T-2毒素抑制造血细胞红系分化中也发挥着协同作用。丁酸钠和过氧化氢对照组也有大量与三羧酸循环和能量代谢相关蛋白差异性表达，如乙酰CoA转移酶、3-羟基乙酰CoA脱氢酶，苹果酸脱氢酶、NADPH、丙酮酸激酶，表明阴性对照丁酸钠诱导造血细胞红系分化和阳性对照过氧化氢抑制红系分化中，都有能量代谢和物质代谢变化参与其中，与基因芯片结果存在一定的相关性。用Western blot验证HSP27蛋白的表达，结果与双向电泳结果一致。
　　 综上，本研究首次发现了转铁蛋白及血红素合成过程是T-2毒素抑制造血细胞分化过程中的重要分子靶点，JAK2-STAT5B参与了T-2毒素对造血系统毒性，并在T-2毒素引起K562细胞周期阻滞中有重要作用。细胞内物质和能量代谢相关基因和蛋白水平改变，是T-2毒素介导的造血系统毒性的另一条重要途径。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

1 前言

1.1 T-2毒素毒性概况

1.2 T-2毒素对造血系统毒性研究概况

1.3 T-2毒素与氧化应激的关系

1.4 本课题研究技术

1.5 研究目标和内容

2 材料方法

2.1 细胞株

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4 主要试剂的配制

2.5 细胞培养及冻存

2.6 细胞活力测定

2.6.1 MTT试验

2.6.2 乳酸脱氢酶(LDH)释放测定

2.7 细胞红系分化检测

2.71 T-2毒素影响K562细胞红系分化时间和剂量确定

2.7.2 AG490和芦荟苷对K562细胞红系分化的影响

2.8 细胞内活性氧ROS检测

2.9 K562细胞基因表达谱检测

2.9.1 总RNA的提取和纯化

2.9.2 cDNA的合成和纯化

2.9.3 IVT合成cRNA和cRNA的纯化

2.9.4 cRNA片段化

2.9.5 芯片杂交

2.9.6 芯片洗脱

2.9.7 芯片扫描

2.10 实时荧光定量PCR验证基因芯片中差异基因的mRNA表达

2.10.1 细胞总RNA提取

2.10.2 cDNA合成

2.10.3 相关实时荧光定量Real-time PCR

2.10.4 荧光定量数据分析

2.10.5 统计学分析

2.11 Western Blot方法验证p-STAT5B蛋白表达情况

2.11.1 细胞处理及分组

2.11.2 细胞蛋白提取及浓度测定

2.11.3 SDS-PAGE凝胶电泳

2.11.4 转膜

2.11.5 封闭

2.11.6 一抗孵育

2.11.7 二抗孵育

2.11.8 化学发光显色

2.12 细胞周期检测

2.13 双向电泳技术检测K562细胞差异蛋白质组学研究

2.13.1 细胞处理及分组

2.13.2 细胞总蛋白的制备

2.13.3 蛋白质定量

2.13.4 蛋白质水化上样

2.13.5 一相等点聚焦(IEF)

2.13.6 IPG胶条平衡

2.13.7 二相SDS-PAGE电泳

2.13.8 染色

2.13.9 图像扫描及分析

2.14 蛋白质质谱鉴定

2.14.1 胶内酶解

2.14.2 MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索

3 结果

3.1 T-2毒素所致K562细胞剂量及时间依赖性毒性作用

3.2 T-2毒素对K562细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响

3.3 T-2毒素对K562细胞红系分化的影响

3.4 T-2毒素对K562细胞内氧自由基(ROS)释放的时效规律

3.5 K562细胞基因表达谱检测

3.5.1 总RNA质量的鉴定

3.5.2 差异基因数量分析

3.5.3 差异基因数量分析

3.6 Real-time PCR验证基因芯片中部分差异基因的mRNA表达

3.6.1 RNA提取质量的鉴定

3.6.2 相关基因定量溶解曲线和标准曲线

3.6.3 通路关键基因mRNA表达水平的验证

3.6.4 红系分化相关基因mRNA表达水平的验证

3.6.5 荧光定量PCR验证基因与芯片结果对比情况

3.7 T-2毒素对p-STAT5B蛋白表达的影响

3.8 Western blot验证T-2毒素对MS4A3蛋白表达的影响

3.9 JAK-STAT通路特异性抑制剂对K562细胞红系分化的影响

3.10 T-2毒素对K562细胞周期的影响

3.11 双向电泳寻找T-2毒素作用K562细胞后差异表达蛋白结果

3.11.1 蛋白质定量

3.11.2 T-2毒素对K562细胞差异蛋白质组学分析

3.11.3 差异蛋白点质谱鉴定结果

3.10.4 Western blot验证双向电泳结果

4 讨论

4.1 T-2毒素影响K562细胞红系分化的毒性作用

4.2 T-2毒素对K562细胞氧自由基释放的机制

4.3 基因芯片剂量、时间选取依据

4.4 T-2毒素对K562细胞毒性靶基因功能分析

4.4.1 造血细胞分化相关基因

4.4.2 细胞周期调控相关基因

4.4.3 合成代谢相关基因

4.4.4 细胞信号转导相关基因

4.5 基因芯片结果验证基因选取理由及结果

4.6 T-2毒素对K562细胞毒性靶蛋白功能分析

4.7 基因芯片及双向电泳结果之间的关系

4.8 T-2毒素影响K562细胞向红系细胞分化的分子机理

5 全文总结

6 文献综述：单端孢毒素毒性作用及信号转导通路

6.1 单端孢霉烯族毒素的危害

6.1.1 T-2毒素的危害

6.1.2 雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)的危害

6.1.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)的危害

6.2 毒理学

6.2.1 T-2毒素

6.2.2 雪腐镰刀菌烯醇(NIV)

6.2.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)

6.3 单端孢霉烯族毒素毒性的分子机制

6.3.1 T-2毒素毒性的分子机制及信号通路

6.3.2 DON毒性的分子机制及信号通路

6.4 结论与展望

参考文献

致谢

作者简介

附录