T-2毒素影响K562细胞向红系细胞分化的分子机理研究

摘要

T-2毒素是由镰刀菌产生的毒性最强的A族单端孢霉烯族毒素，是全球粮谷类最常见的污染性霉菌毒素。动物或人食入被该毒素污染的食物会导致食物中毒性白细胞缺乏症、单端孢霉烯族中毒症、大骨节病、人畜赤霉粮中毒症和克山病等多种疾病。临床上，中毒症状主要表现为拒食、腹泻、呕吐、贫血、免疫力下降、内脏器官的出血、骨髓组织的坏死、母畜不孕或流产甚至死亡。
　　造血系统是T-2毒素的主要靶器官之一，它对造血系统的损伤作用以及对外周血样的毒性作用大于同类毒素。毒素进入机体后引起造血器官损伤，导致骨髓组织坏死，影响多能干细胞的功能，使多种血液成分的数量比例失衡，表现为:骨髓和脾脏红髓细胞损伤、骨髓发育不全、血液系统内造血细胞数目显著减少、红细胞计数和容积下降、贫血以及红细胞溶血等症状。正常动物体内的红细胞是由多能干细胞向红系细胞分化而来的，因此，为了阐释T-2毒素引起造血系统损伤的作用机理，研究T-2毒素影响造血干细胞分化的分子作用机理是非常必要的。然而，前人对多能干细胞向红系细胞的分化进行研究，仅得到了参与分化过程的部分基因家族和信号通路，并未对红系分化的分子机理进行系统研究，且毒素影响多能干细胞向红系细胞分化过程的分子机理目前鲜有研究。
　　本实验室前期以处于多能干细胞阶段的K562细胞为模型，发现T-2毒素可抑制K562细胞的红系分化过程，并用基因芯片和二维电泳技术对基因和蛋白的表达水平进行检测，得到了981个差异表达基因和22个差异表达蛋白。本课题在本实验室前期研究结果的基础上对差异表达基因和蛋白进行筛选，得到了可能参与红系分化的8个差异表达基因和4个差异表达蛋白，运用实时荧光定量PCR、Western bolt、RNAi和流式细胞术，对T-2毒素作用下基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平以及细胞分化水平进行检测，探讨T-2毒素抑制K562细胞向红系细胞分化的分子作用机理，为揭示单端孢霉烯族毒素的血液系统毒性作用机制提供理论依据。
　　本课题首先在实验室前期研究的基础上，筛选T-2毒素作用下表达水平变化较大(Folds≥2)的基因和蛋白，在此筛选结果的基础上选择阴性对照组(0.6 mM丁酸钠)中表达水平变化趋势与T-2毒素处理组相反，且在阳性对照组(1 mM H2O2)中表达水平变化趋势与T-2毒素处理组相同的基因和蛋白。对基因芯片的结果进行分析筛选，得到了8个可能参与T-2毒素抑制红系分化过程的基因，分别是:PI3K、MS4A3、EPAS1、ZNF382、SQSTM1、INSIG1、KDM4D和GPSM2。对二维电泳的结果分析后得到了HSP27、PRDX3、PSMC2和ACTR1A等4个可能与红系分化有关的差异表达蛋白。
　　为研究T-2毒素抑制多能干细胞向红系分化的调控途径，本实验分别设置空白对照组、T-2毒素处理组和T-2毒素与信号通路抑制剂共处理组，不同化合物分别与细胞共孵育24 h和48 h后，用CD235a-FITC抗体与红细胞表面特异性抗原CD235a结合，然后用流式细胞仪检测CD235a的表达量，从而判断细胞的红系分化率。通过比较不同处理组中CD235a表达量的变化，发现JAK2-STAT3信号通路促进红系分化，而NF-κB信号通路则抑制红系分化过程，且T-2毒素可通过JAK2-STAT3、p38、ERK、JNK和NF-KB信号通路调控K562细胞向红系分化的过程。
　　为检测T-2毒素与筛选所得基因和蛋白间的关系，用15 nM T-2毒素分别处理细胞2h、6h、12h、24 h和48 h后，提取细胞总RNA，检测各基因的mRNA表达水平与T-2毒素间的时效关系。在基因表达水平变化最显著的时间点用信号通路抑制剂分别预处理细胞后，再加入T-2毒素，结果表明，T-2毒素可通过JAK2正调控HSP27、PSMC2、SQSTM1和ZNF382基因的表达水平，且负调控ACTR1A基因的表达水平;通过STAT3抑制PI3K、ACTR1A、INSIG1和PRDX3基因的表达，而对HSP27、SQSTM1、EPAS1和KDM4D基因的表达起促进作用;通过p38信号通路对INSIG1和PRDX3基因的表达水平进行负调控，但可促进HSP27基因的表达水平;也可通过JNK正调控SQSTM1和ZNF382基因的表达水平，负调控ACTR1A基因的表达水平;亦可通过ERK信号通路促进SQSTM1、EPAS1和ZNF382基因的表达;还可通过NF-κB信号通路使KDM4D、SQSTM1和ZNF382基因的表达水平显著上调，且抑制ACTR1A基因的表达。
　　随后，运用RNA干扰技术使目的基因表达沉默，对MS4A3基因在红系分化中的作用进行了深入研究。用脂质体(LipofectamineTM2000)转染自身带有荧光信号的siRNA，显微镜下观察发射荧光信号的细胞，通过计算发射荧光信号的细胞占总细胞数的比例，计算转染效率。当加入siRNA的剂量为30 ng时转染效率在70％以上，且细胞生长状态良好，符合实验要求，即K562细胞适合用脂质体转染siRNA的方法使基因表达沉默。用多项研究已证明了的对任何基因表达水平无显著影响的siRNA作为阴性对照，用看家基因GAPDH的特异性siRNA作为阳性对照，检测发现30 ng时GAPDH的表达水平极显著下调，这说明该方法可行，且GAPDH可作为RNA干扰实验的阳性对照。本课题还设计了两条特异性使目的基因MS4A3表达沉默的siRNA序列(s2609和s2610)，经检测s2609比s2610稳定性强，且符合实验要求。MS4A3的表达被沉默后，K562细胞的红系分化率下调极显著，表明MS4A3在红系分化中起促进作用;检测筛选所得的其他基因和蛋白质的表达水平，发现与干扰前相比，GATA-1和HSP27基因的表达水平上调极显著，ZNF382和SQSTM1基因的表达水平极显著下调，这表明这些基因位于MS4A3的下游，且MS4A3基因正调控ZNF382和SQSTM1基因的表达，而对GATA-1和HSP27基因的表达起负调控作用;对HSP27的基因和蛋白水平检测发现T-2毒素可通过MS4A3基因对HSP27-GATA-1的表达水平起抑制作用，从而抑制K562细胞的红系分化过程。
　　综上所述，本课题首先对本实验室的前期研究结果进行了分析筛选，得到了可能参与T-2毒素影响造血干细胞向红系细胞分化过程的8个差异表达基因和4个差异表达蛋白;通过对T-2毒素与信号通路的关系、信号通路与基因（蛋白）的关系和T-2毒素与基因（蛋白）的调控关系进行了研究，找到了T-2毒素调控红系分化的重要信号通路，以及这些信号通路对筛选所得基因（蛋白）的调控作用;首次对MS4A3基因在红系分化过程中的作用进行研究，得到了MS4A3基因与其他红系分化相关基因间的调控关系，确定了该基因在红系分化过程中的重要作用;系统阐释了T-2毒素抑制K562细胞向红系细胞分化的分子作用机理，为进一步研究单端孢霉烯族毒素对造血系统的毒性机理提供了重要参考。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 立题依据

1．2 T-2毒素造血系统的毒素研究进展

1．3 K562细胞向红系分化的研究进展

1．4 筛选所得差异表达基因(蛋白)功能的研究进展

1．5 研究目标和内容

2 材料方法

2．1 细胞株

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂的配制

2．5 差异基因和差异蛋白的筛选

2．6 细胞培养及冻存

2．7 实时荧光定量PCR检测相关基因mRNA的表达

2．7．1 细胞处理及实验分组

2．7．2 总RNA的提取

2．7．3 总RNA纯度及完整性的检测

2．7．4 逆转录反应

2．7．5 实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA表达水平

2．7．6 荧光定量数据分析

2．8 Western blot方法测定相关蛋白磷酸化水平

2．8．1 细胞处理及实验分组

2．8．2 总蛋白的提取

2．8．3 蛋白浓度测定

2．8．4 SDS-PAGE电泳

2．8．5 Western印迹杂交

2．9 RNA干扰技术检测MS4A3在红系分化中的作用

2．9．1 细胞处理及实验分组

2．9．2 RNA干扰实验

2．10 细胞红系分化检测

2．10．1 流式细胞仪检测红系分化

2．10．2 T-2毒素及信号通路抑制剂对K562细胞向红系细胞分化的影响

2．10．3 MS4A3基因对红系分化的影响

2．11 统计学分析

3．结果

3．1 红系分化潜在的功能基因和蛋白

3．2 K562细胞培养

3．3 引物设计及检测

3．3．1 引物设计

3．3．2 RNA质量鉴定

3．3．3 引物可靠性检测

3．4 差异基因(蛋白)在T-2毒素影响K562细胞向红系分化中的作用

3．4．1 T-2毒素和信号通路抑制剂对K562细胞向红系分化的影响

3．4．2 T-2毒素影响差异基因mRNA表达水平的时效关系

3．4．3 差异基因(蛋白)与信号转导通路间的关系

3．5 MS4A3在红系分化中的作用

3．5．1 siRNA干扰效率与剂量

3．5．2 MS4A3与K562细胞向红系分化的关系

3．5．3 信号通路对MS4A3基因的调控作用

3．5．4 MS4A3基因与其他差异表达基因(蛋白)间的关系

4．讨论

4．1 红系分化检测方法的确定

4．2 红系分化相关的基因和蛋白的选择

4．3 T-2毒素抑制K562细胞分化的途径

4．4 MS4A3是T-2毒素调控红系分化的关键基因

4．5 红系分化相关的潜在分子机理

5．结论

6 文献综述：单端孢霉烯族毒素的毒性作用机理研究进展

6．1 引言

6．2 单端孢霉烯族毒素的特性

6．2．1 T-2毒素的特性

6．2．2 雪腐镰刀菌烯醇的特性

6．2．3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)的特性

6．3 单端孢霉烯族毒素的毒性

6．3．1 急性毒性

6．3．2 血液系统毒性

6．3．3 免疫系统毒性

6．3．4 细胞毒性

6．3．5 神经毒性

6．3．6 遗传毒性

6．3．7 致癌、致畸、致突变作用

6．4 单端孢霉烯族毒素毒性作用的分子机制

6．4．1 单端孢霉烯族毒素诱导细胞凋亡的分子机制

6．4．2 单端孢霉烯族毒素影响细胞增殖的分子机理

6．4．3 单端孢霉烯族毒素对mRNA翻译的抑制作用

6．4．4 单端孢霉烯族毒素对MAPKs信号通路的影响

6．5 结论与展望

参考文献

致谢

作者简介

附录