梅花鹿激素及其受体基因变异对产茸量的调控效应研究

摘要

影响梅花鹿产茸量的因素很多，如何克服不良影响因素、以提高产茸量一直是人们追求的目标。了解鹿茸生长发育调控规律，可以促进提高鹿茸产量的新技术发展；开发操作简便、结果可靠的选种方法，培育产茸量高的新品种，是提高梅花鹿产茸量的基本手段。鉴于梅花鹿养殖中目前存在的选种方法落后的状况，本研究以湖北白鹿春实业有限公司梅花鹿养殖场(n=302)和吉林省东丰县东丰药业股份有限公司养鹿场人工养殖梅花鹿(n=234)种群为研究对象，通过分析生长激素(GH)、褪黑激素Ⅰ型受体a亚型(MTNR1A)基因和雄激素受体(AR)基因的单核苷酸多态性及其与产茸性状的关系，寻找SNP位点，为建立梅花鹿产茸性状分子标记辅助选择方法奠定基础；同时，应用生物信息学软件对已扩增得到的梅花鹿褪黑素受体基因进行蛋白结构与功能分析，为阐明鹿茸生长发育调控规律、开发提高产茸量的新技术奠定基础。主要研究结果如下：
　　 1.梅花鹿激素及其受体基因多态性与产茸量的关系
　　 (1)GH基因多态性及其与产茸量的关系：在2个梅花鹿种群中，发现GH基因3个突变位点，并被GeneBank收录，即A176-G176突变(登录号：GQ438251.1)，A45-G45突变和C139-T139突变(登录号：GQ438253.1)，A176-G176突变导致StuI限制性内切酶位点的改变。利用PCR-RFLP技术进行基因分型，分析基因的多态性及其与产茸估测值之间的关系，发现两个梅花鹿种群各基因型之间的产茸估测值差异不显著(P>0.05)；A45-G45突变未引起限制性内切酶位点的改变，因此用AS-PCR引物，进行基因分型。而后将基因的多态性与产茸估测值之间进行关联分析，发现两个梅花鹿种群各基因型的产茸估测值都没有差异(P>0.05)；C139-T139突变也未引起限制性内切酶位点的改变，用AS-PCR引物进行基因分型，并分析基因多态性与产茸估测值之间的关系，发现在五三梅花鹿种群中各基因型之间的产茸估测值没有差异(P>0.05)，而在东丰梅花鹿种群中，CT基因型和CC基因型的产茸量估测值显著高于TT基因型(P<0.05)。
　　 (2)MINR1A基因多态性及其与产茸量的关系：在2个梅花鹿种群中，MTNR1A基因外显子2出现3个突变，测定其分子结构后提交并被GeneBank收录，即C518-T518、G629-C629和C635-T635突变(登录号：JN038179)。C518-T518突变引起Ecol881酶切位点的改变，利用PCR-RFLP方法进行基因分型，然后分析基因多态性及其与产茸估测值之间的关系，发现在两个梅花鹿种群中各基因型之间的产茸估测值都没有差异(P>0.05)；在G629-C629处突变能引起Mval酶切位点的改变。利用PCR-RFLP方法进行基因分型，并分析基因多态性与产茸估测值之间的关系，发现在五三梅花鹿种群中，CC基因型的产茸估测值显著高于GC基因型(P<0.05)，GC基因型的产茸估测值显著高于GG基因型(P<0.05)，而CC基因型与GC基因型之间没有达到统计学差异水平(P>0.05)。C635-T635突变未引起限制性内切酶位点的改变，所以用AS-PCR引物进行基因分型，然后分析基因多态性与产茸估测值之间的关系，发现在两个梅花鹿种群的各基因型之间，产茸估测值都没有差异(P>0.05)。
　　 (3)AR基因多态性及其与产茸量的关系：在2个梅花鹿种群中，AR基因存在2个突变位点，测序后提交并被GeneBank收录，外显子3的C75-T75和外显子8的C256-T256(登录号：JF719040)位点。C75-T75突变引起RsaⅠ酶切位点改变，利用PCR-RFLP方法进行基因分型，然后分析基因多态性与产茸估测值之间的关系，发现在五三梅花鹿群体中，CT基因型的产茸量估测值高于CC基因型(P<0.05)，而CT基因型与TT基因型以及TT基因型与CC基因型之间没有差异(P>0.05)。在东丰梅花鹿群体中，CT基因型的产茸量估测值高于CC基因型(P<0.05)，而CT基因型与TT基因型以及TT基因型与CC基因型之间没有差异(P>0.05)；C256-T256突变通过SSCP-PAGE技术进行基因分型，分析基因多态性及其与产茸估测值之间的关系。发现该位点仅在五三梅花鹿种群中存在多态性，但各基因型之间的产茸估测值没有达到统计学差异(P>0.05)。
　　 2.梅花鹿雄激素受体和褪黑素受体结构分析与功能预测
　　 (1)应用Clustal W多序列比对模式对MTNR1A氨基酸序列与9种其他脊椎动物比对，发现梅花鹿中该基因编码的氨基酸序列与其他动物一样保守，在MTNR1A编码序列864位的核苷酸由G突变为C，导致氨基酸突变。比较G突变前、后所编码蛋白的理化特性，证明该蛋白非常稳定。
　　 (2)分析梅花鹿MTNR1A基因的分子进化树，发现MTNR1A基因的进化与其他物种的进化非常一致，梅花鹿和牛属于反刍动物，故分歧时间晚于鸟类前于高等动物，说明在GPCR进化历程中，梅花鹿同样遵循物种分化的规律。
　　 (3)应用SMART蛋白功能区域预测软件，预测MTNR1A编码序列有7个跨膜区段，为7次跨膜蛋白，在864bp位点的R288S突变体位于NRF蛋白保守功能区域。应用神经网络算法和Hidden Markov models模型，得到了两种可能的信号肽剪接位点，分别是33-34位和61-62位。
　　 (4)分析MTNR1A基因编码蛋白的二级结构特征，发现864bp处唯一引起氨基酸改变的突变，位于第6次跨膜和第7次跨膜之间的细胞外信号分子结合位点区域的LOOP区，该区域暴露于细胞膜之外，是可能参与下游信号分子传导的功能区。
　　 (5)分析MTNR1A家族成员，发现其属于GPCR家族A成员，与视紫红质有55%的同源性，突变氨基酸位于细胞外的袢环位置，可能对褪黑素配体的结合以及激活受体密切相关，说明梅花鹿的褪黑素受体可能存在物种特异性的结合及其激活机制，提示该位点可能是活性位点。
　　 (6)采用IPA蛋白互作网络分析，发现MTNR1A除了与其配体褪黑素结合外，还与众多基因、转录因子、接头蛋白等相互作用，形成复杂的调控网络。MTNR1A是一类重要的GPCR受体，与生物体诸多生理功能有关。该互作调控网络显示MTNR1A可能与MTNR1B结合，形成异二聚体发挥作用。该受体与CREB、ELK1/2等相互作用，决定细胞的增殖与分化功能。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表(Abbreviation words)

第一部分 文献综述

1 影响梅花鹿产茸性状的因素研究进展

1.1 品种和品系

1.2 营养水平

1.3 光照

1.4 温度和湿度

1.5 年龄

1.6 收茸时期

1.7 饲养管理水平

2 梅花鹿产茸性状的激素调控研究进展

2.1 生长激素对梅花鹿产茸性状的调控作用研究进展

2.2 褪黑激素及其受体对梅花鹿产茸性状的调控作用

2.3 雄激素及其受体对梅花鹿产茸性状的调控作用

2.4 其他激素及活性物质对梅花鹿产茸性状的调控

3 研究梅花鹿产茸性状分子机制的标记技术

3.1 PCR-SSCP技术

3.2 微卫星标记技术

3.3 AFLP技术

4 生物信息学在基因组和蛋白质研究中的应用

4.1 常用生物信息学数据库

4.2 序列比对

4.3 结构预测

4.4 生物信息学发展趋势

5 研究的目的与意义

第二部分 研究内容

研究一：GH、MTNR1A、AR基因多态性及其与梅花鹿产茸性状关系研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

研究二：梅花鹿MTNR1A基因结构与功能研究

1 前言

2 材料方法

3.结果

4 讨论

第三部分 全文结论和创新点

1 全文结论

2 创新点

参考文献

附录Ⅰ 在读期间发表的学术论文

附录Ⅱ 申报的国家发明专利及获奖情况

附录Ⅲ 近期在Genebank登录的基因片段

附录Ⅳ 参加的学术活动

附件Ⅴ GH、MTNR1A、AR基因序列比对和MTNR1A 2个外显子全序列结果

致谢