多杀性巴氏杆菌全基因组测序与比较基因组学分析

摘要

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种重要的多宿主病原菌，可引起猪萎缩性鼻炎(Atrophic thinitis，AR)和猪肺疫(Swine pneumonia)，是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)的重要致病因子之一，同时还是禽霍乱(Fowl cholera)、牛和水牛、羊以及家兔等动物出血性败血病(Haemorrhagic septicaemia，HS)的病原菌。该类细菌广泛流行于世界各地，给养殖业造成了巨大的经济损失。多杀性巴氏杆菌已知的毒力因子(Virulence factor，VF)包括荚膜、脂多糖、毒素和外膜蛋白等，很多关键的毒力因子尤其是致病的特异性因子有待进一步挖掘。目前公布的仅两株多杀性巴氏杆菌全基因组序列限制了我们从全基因组水平解释Pm的致病特征。因此，为了更全面的研究多杀性巴氏杆菌的遗传变异规律及致病因子，我们进行了多株多杀性巴氏杆菌全基因组测序与分析等研究，具体内容如下：
　　 1.多杀性巴氏杆菌全基因组测序与分析
　　 我们运用Solexa方法对7株多杀性巴氏杆菌的全基因组序列进行了测定。经过拼接，获得了7株Pm基因组的草图序列，各序列的大小从2.22 Mb到2.36 Mb不等。我们选取了菌株HB03和HN06进行了基因组缺口的人工修补和注释，获得了2株Pm环状全基因组序列。HB03基因组大小为2，307，684 bp，平均GC含量为40.4%，编码2，118个CDS，6个核糖体16s-23s-5s rRNA操纵子和53个tRNA(GenBank登录号：CP003328)；HN06基因组大小为2，402，218 bp，平均GC含量为40.2%，编码2，258个CDS，6个核糖体16s-23s-5s rRNA操纵子和56个tRNA(GenBank登录号：CP003313)。另外，HN06菌株中还包含1个大小为5，360 bp的质粒pHN06(GenBank登录号：CP003314)，其GC含量为47.5%，编码7个CDS。同时，对两株菌的假基因、噬菌体相关编码基因及双组份调控系统等基本特征进行了分析。
　　 2.多杀性巴氏杆菌全基因组水平核苷酸比较分析
　　 我们将本研究中完整测序菌株HB03和HN06与GenBank数据库中已经公布的菌株Pm70(GenBank登录号：NC002663)和36950(GenBank登录号：CP003022)的完整序列一起进行了全基因组共线性比较分析，发现多杀性巴氏杆菌基因组中存在插入缺失和重排现象。Pm70与其余3株相比，存在5个较大区域的倒位，另外3株Pm基因组的共线性较好。进一步以HB03为参考，分析了其余3株菌相对于HB03而言基因组中插入和缺失的基因组区域。4株菌之间非匹配区域的平均长度为226kb，占HB03基因组总长度的9.8%。HB03基因组中缺失和插入基因组区域的平均长度分别为6，704 bp和7，117 bp。HB03与其余3株菌相比，存在两个分别为37，342bp和18，757 bp的特有基因组区域，分析推测，前者是从噬菌体整合而来，后者为四环素类耐药基因岛。同时分析了HN06基因组相对于HB03而言3个36 kb以上的插入基因组区域，其中最大的区域编码62个CDS，是1个包含toxA毒力基因的前噬菌体序列。根据功能注释推测，另外两个基因组区域也从噬菌体水平转移而来。比较发现，这三个基因组区域在Pm70和36950中也不存在，为HN06基因组特有区域。
　　 3.多杀性巴氏杆菌基因组水平的蛋白质成分比较分析
　　 运用两种方法比较分析了4株多杀性巴氏杆菌蛋白质编码基因的分布，1812个HB03蛋白质基因在4个Pm基因组中高度保守，79个HB03蛋白质基因在其余3个Pm基因组中具有显著的遗传多样性。4株多杀性巴氏杆菌的总基因簇为2，687个，其中核心基因簇数为1，789个，占总基因簇66.6%，至少在两株菌中分布的非核心基因簇的有261个，占总基因簇的9.7%；剩余的23.7%为各个菌株所特有的基因簇。分析同时只在两株菌中共有的基因簇发现，36950与HB03共有的基因簇(67个)明显多余其他组合。各个菌株特有的基因以HN06菌株最多，为297个。同时，挖掘了这些差异区域编码基因的生物学功能，展示了荚膜合成基因簇、脂多糖合成基因簇和Flp操纵子在4株菌之间的差异。
　　 4.多杀性巴氏杆菌基因组进化分析
　　 利用4株多杀性巴氏杆菌基因组之间45，871个SNP位点，串联后绘制了系统发育邻接树。4株菌分布在3个不同的分支，菌株HB03与36950的亲缘关系较近，而与HN06亲缘关系较远。这一结果与核苷酸水平和氨基酸水平分析结果相一致。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略词(Abbreviation)

1 文献综述

1.1 微生物基因组学

1.1.1 微生物基因组学的研究历史

1.1.2 微生物基因组测序进展

1.1.3 微生物基因组测序技术的发展

1.1.4 微生物基因组学研究的应用

1.2 多杀性巴氏杆菌的研究进展

1.2.1 多杀性巴氏杆菌的生物学特性与分型

1.2.2 多杀性巴氏杆菌的流行与危害

1.2.3 多杀性巴氏杆菌毒力因子的研究进展

1.2.4 多杀性巴氏杆菌基因组学的研究进展

2 研究的目的和意义

3 材料和方法

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 主要工具酶及试剂

3.1.3 主要培养基的配制

3.1.4 主要仪器与设备

3.2 方法

3.2.1 测序菌株的筛选

3.2.2 细菌全基因组的提取

3.2.3 多杀性巴氏杆菌基因组序列的测定

3.2.4 多杀性巴氏杆菌完整基因组注释与分析

3.2.5 多杀巴氏杆菌比较基因组学分析

3.2.6 多杀性巴氏杆菌基因组进化分析

4 结果与分析

4.1 所测多杀性巴氏杆菌的基本特征

4.2 所测多杀性巴氏杆菌基因组一般特征

4.2.17株多杀性巴氏杆菌基因组拼接结果初步统计

4.2.24株多杀性巴氏杆菌全基因组基本特征

4.2.3 假基因的分析

4.2.4 噬菌体相关编码基因

4.2.5 双组份调控系统

4.34株多杀性巴氏杆菌比较基因组学分析

4.3.1 核苷酸水平的比较分析

4.3.2 氨基酸水平的比较分析

4.44株多杀性巴氏杆菌基因组局部区域比较分析

4.54株多杀性巴氏杆菌基因组进化分析

5 讨论

5.1 测序菌株的筛选与基因组测序

5.2 基因组学与比较基因组学分析

5.3 局部区域比较分析

5.4 下一步工作展望

6 结论

参考文献

附录

致谢

附表