鸡卵黄免疫球蛋白的分离纯化、mPEG修饰及其稳定性研究

摘要

鸡卵黄免疫球蛋白，简称IgY(chicken eggyolk immunoglobulin)，又称鸡卵黄抗体，是由血液中IgG被选择性地转移到卵黄中唯一的免疫球蛋白类。由于IgY是蛋白质类大分子，具有一定的免疫原性，当其用于机体时，会引发抗体产生而降低疗效，并且易受温度、酸碱、酶的影响，从而限制了IgY的应用领域。本文针对这一问题，制备了mPEG化IgY，主要研究内容为：鸡IgY分离纯化，mPEG化学修饰，以及修饰前后的IgY稳定性进行对比研究。研究结果如下：
　　 1.建立了一种高效、经济、大规模分离纯化鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的生产方法，即在对传统水稀释法改良的基础上，结合聚乙二醇沉淀与离子交换色谱进行IgY的分离纯化。具体工艺为新鲜鸡蛋经过分离得到蛋黄液，经水稀释后，离心得上清液，向上清液中加入PEG6000沉淀蛋白，沉淀物经透析、冷冻干燥之后经过一步离子交换法进行纯化，并对具体工艺条件进行了优化。实验结果显示，用8倍无菌水稀释蛋黄液，用0.1 mol/L HCl调节pH为5.2，在4℃下静置8h，于5000×g力离心可得上清粗IgY，经测定回收率可达93.47%。然后用6%聚乙二醇沉淀后经DEAE-Toyopearl650 M离子交换纯化，最佳的纯化条件：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7)平衡上样，0.075 mol/L PBS(pH7)洗脱。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示所得的IgY的纯度为95%，活性保持率高达73.77%。本研究弥补了传统分离方法不能同时达到高纯度和高回收率的缺点，且可用于大规模生产。
　　 2.研究了单甲氧基聚乙二醇(mPEG)对鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的化学修饰，并通过傅里叶变换红外光谱、圆二色光谱和荧光光谱分析比较了修饰前后IgY的稳定性。具体修饰方法为：mPEG经NHS活化，得NHS-mPEG，冷冻干燥，NHS-mPEG对IgY进行化学修饰，得mPEG-IgY。mPEG对IgY进行修饰过程中，通过对各种修饰条件的摸索和比较优化，最后筛选出mPEG最佳修饰反应条件为：IgY与活化后的mPEG按摩尔比1:10，pH7条件下反应1h可得修饰率为20.56%的mPEG-IgY，IgY活性保持率可达90%。修饰前的IgY二级结构中α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random分别为14.5%、42.1%、6.2%、37.2%；修饰后的mPEG-IgY各二级结构含量分别为9.1%、44.9%、7.4%、38.6%。与修饰前相比，mPEG-IgY的α-螺旋含量降低了约37%，β-螺旋含量升高，其他含量变化不明显。
　　 3.通过光谱分析法对IgY以及mPEG-IgY的热稳定性进行了研究。结果显示，70℃温育120min后，IgY的α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random各二级结构含量由14.5%、42.1%、6.2%、37.2%变为1.6%、55.25%、5.8%、37.5%；mPEG-IgY的各二级结构含量由12.9%、42.7%、6.3%、38.1%变为3.1%、50.5%、7.2%、39.2%。热动力学分析表明，IgY热变性反应级数为1级，在65、70、75、80、85、90℃加热条件下，D值分别为：166.67、37.59、6.48、2.92、1.79、1.13 min；此温度范围内的Z值为11.5℃，表观活化能Ea=200.841 kj/mol，焓值分别为198.0296、197.988、197.9465、197.9049、197.8633、197.8218 kJ/mol，熵值分别为58.66751、58.65283、58.63837、58.62411、58.59619 kJ/(mol·K)，吉普斯自由能分别为33.09298、30.65444、28.2166、25.77931、23.34261、20.90646 kJ/mol。mPEG-IgY热变性反应级数为1级，在65、70、75、80、85、90℃加热条件下，D值分别为：208.33、60.61、8.02、4.48、2.50、2.18min；此温度范围内的Z值为12.22℃，表观活化能Ea=186.915 kJ/mol，焓值分别为84.1036、184.0621、184.0205、183.9789、183.9373、183.5958 kJ/mol，熵值分别为53.50651、53.49183、53.47737、53.62411、58.61005、58.59619 kJ/(mol·K)，吉普斯自由能分别为33.67654、31.45257、29.2292、27.00644、24.78425、22.26271 kJ/mol。
　　 4.对IgY以及mPEG-IgY不同酸碱条件下的稳定性进行了研究。结果显示，在4h、pH11条件下mPEG-IgY活性保持率比IgY活性保持率高接近五倍。圆二色光谱扫描分析显示，在pH4处理条件下，IgY的α螺旋含量降低了76.4%，而修饰后的IgY降幅减少15.7%；IgY以及mPEG-IgY的p折叠含量均有所增高，增幅分别为18.4%和29.7%。在pH11条件下圆二色光谱扫描结果为IgY的α螺旋含量降低了71.1%，而修饰后的IgY降幅减少14.9%；IgY以及mPEG-IgY的β折叠含量均有所增高，增幅分别为16.5%和21.7%。说明IgY经过mPEG修饰以后所得产物对酸碱有着更高的耐受力。
　　 5.对IgY以及mPEG-IgY在模拟胃肠液消化系统中的稳定性进行了研究。结果显示，在pH4的模拟胃液消化过程中，反应30～45 min时间段内，IgY活性保持率由83.57%变为55.59%，活性降低28.08%；mPEG-IgY活性保持率由89.81%变为72.63%，活性降低17.18%。反应90～120 min时间段内，IgY活性保持率由46.24%变为31.33%，活性降低14.91%；mPEG-IgY活性保持率由63.21%变为60.44%，活性降低2.77%。pH2条件下，对比IgY以及mPEG-IgY活性保持率可以发现，反应30～45 min时间段内，IgY活性保持率由71.69%变为50.37%，活性降低21.32%；mPEG-IgY活性保持率由83.33%变为65.25%，活性降低18.08%。反应90～120 min时间段内，IgY活性保持率由41.36%变为20.69%，活性降低20.67%；mPEG-IgY活性保持率由55.49%变为49.82%，活性降低5.67%。氨基酸成分分析结果显示，修饰前以及修饰后的IgY，氨基酸成分以及含量基本一致，说明IgY在经过mPEG修饰之后一级结构并没有被破坏。寡肽成分分析结果表明，经消化液酶解后，mPEG-IgY寡肽的种类和数量减少，说明经IgY过修饰后比修饰前有着更强的胃蛋白酶、胰蛋白酶稳定性。因此可知经过修饰后的IgY比没有修饰的天然IgY有着更强的胃蛋白酶、胰蛋白酶稳定性。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 禽蛋中卵黄球蛋白简介

1.1 卵黄球蛋白的种类及性质

1.2 免疫球蛋白(Ig)的结构与功能

1.3 鸡卵黄免疫球蛋白的特性

2 免疫球蛋白在禽类体内的转移过程

2.1 母体血清到蛋黄中的转移

2.2 胚胎卵囊到胚胎血液中的转移

3 IgY的分离纯化

3.1 水溶性组分的分离

3.2 IgY的分离纯化

4 IgY的应用研究

4.1 IgY在食品中的应用

4.2 IgY在畜禽产业中的应用

4.3 IgY在临床上的应用

4.4 新型饲料添加剂

4.5 在人类抗生育方面的应用

5 蛋白质的PEG修饰

5.1 PEG修饰技术

5.2 PEG修饰对蛋白质性质和生物活性的影响

5.3 PEG修饰方法

6 研究的目的意义及主要研究内容

6.1 研究目的及意义

6.2 主要研究内容

第二章 鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的分离纯化及鉴定

1.材料与方法

1.1原料于试剂

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 水稀释法工艺条件对IgY分离效果的影响

2.2 不同浓度的PEG6000对IgY沉淀效果的影响

2.3 离子交换法纯化IgY条件的确定

2.4 产品回收率、纯度以及活性测定

3 小结与讨论

第三章 鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的mPEG化学修饰

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 mPEG活化度的测定

2.2 NHS活化对mPEG红外光谱图的影响

2.3 不同修饰条件对修饰效果的影响

2.4 IgY以及mPEG-IgY红外光谱分析

3 小结与讨论

第四章 热处理对IgY以及mPEG-IgY性质的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 不同温度处理下IgY以及mPEG-IgY变性率测定结果

2.2 不同温度处理下IgY以及mPEG-IgY活性保持率测定

2.3 热动力学分析

2.4 CD光谱测定热处理过程中二级结构的变化

3 小结与讨论

第五章 酸碱处理对IgY以及mPEG-IgY性质的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 不同pH对IgY以及mPEG-IgY蛋白质活性含量的影响

2.2 不同pH对IgY以及mPEG-IgY蛋白质活性保持率的影响

2.3 不同pH对IgY以及mPEG-IgY荧光光谱的影响

2.4 不同pH对IgY以及mPEG-IgY CD光谱的影响

3 小结与讨论

第六章 IgY以及mPEG-IgY在模拟消化液中稳定性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 pH 4的模拟胃液对IgY以及mPEG-IgY稳定性的影响

2.2 pH 2的模拟胃液对IgY以及mPEG-IgY稳定性的影响

2.3 模拟肠液对IgY以及mPEG-IgY稳定性的影响

2.4 IgY以及mPEG-IgY经两步消化后寡肽成分分析

2.5 IgY以及mPEG-IgY经两步消化后氨基酸成分分析

3 小结与讨论

第七章 结论与创新点

1.结论

2.创新点

参考文献

致谢

附录：研究生期间发表的论文列表