中国大鲵主要病害病原学与诊断技术研究

摘要

中国大鲵（Andrias davidianus）俗名“娃娃鱼”，是我国珍稀的名贵特产，属于国家二级保护动物，已被列入CITES公约附录Ⅰ中。近年来，大鲵的人工繁育与养殖在陕西、浙江、湖南、湖北、贵州等省份发展迅速，已经形成具有重大经济价值的产业。然而，随着养殖规模的不断扩大，以及养殖集约化程度的不断提高，养殖大鲵的病害问题日趋严重，给大鲵养殖产业造成了巨大的经济损失。
　　本研究从患病的养殖大鲵体内分离到一株致病菌JZ01，经人工感染健康大鲵，可复制出与自然发病相同的症状，且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的细菌。该致病菌对鲫鱼也有一定的致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定，以及进一步的16S rDNA基因序列和系统发育分析都表明，此致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。药物敏感性试验表明，该菌对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟等9种药物高度敏感。
　　本研究对大鲵虹彩病毒的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明：GSIV对热处理敏感，56℃和65℃处理30 min，均可彻底灭活病毒；GSIV经酸（pH3）和碱（pH10）处理，病毒滴度（TCID50/0.1 mL）与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级，差异极显著（P<0.01）；GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理，病毒滴度与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级，差异极显著（P<0.01）。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著（P>0.05）。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明， GSIV可在鲤上皮瘤细胞系（ Epithelioma papilloma cyprini，EPC），斑点叉尾鮰肾脏细胞系（Channel catfish kidney，CCK），虹鳟鱼性腺细胞系（Rainbow trout gonadal，RTG-2）等细胞中增殖，但在EPC、CCK细胞中增殖速度快，病毒滴度高；GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明，GSIV感染细胞6 h后病毒滴度开始快速上升，进入对数增长期，72 h时病毒滴度达到最大值，以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示，在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒，呈晶格状排列，直径约140 nm。
　　本研究开展了大鲵虹彩病毒MCP基因全长克隆、原核表达、多克隆抗体制备与免疫诊断技术研究。根据大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白（GSIV-MCP）基因序列设计引物，PCR扩增得到 MCP基因编码框全长序列1392 bp，将其克隆至原核表达载体pET-32a中，构建了重组原核表达载体pET-32a-MCP，并在大肠杆菌BL21中得到了表达，融合表达的重组蛋白分子量约为70 kDa，与预期大小一致，主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度，诱导温度等诱导表达条件进行优化，确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备了多克隆抗体，ELISA检测抗体效价大于1:50000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明：该抗体可以对感染EPC细胞的GSIV及患病大鲵肾脏组织中GSIV进行特异性的检测。

目录

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缩略语表（按字母顺序排列）

第一章 文献综述

1.1 中国大鲵

1.2 中国大鲵病害研究进展及现状

1.3 病原的检测与诊断技术

1.4 本论文研究的目的及意义

第二章 患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定

2.1 实验材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 大鲵虹彩病毒理化特性及生物学特性研究

3.1 实验材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及免疫检测

4.1 实验材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

4.4 小结

参考文献

附录

致谢