椪柑多甲氧基黄酮提取物对黑曲霉的抑制活性及机理探讨

摘要

黄酮类化合物是存在于多种植物中的主要天然活性成分，多甲氧基黄酮（polymethoxylated flavones，缩写为PMFs）作为黄酮类化合物的一种，广泛存在于柑橘属植物果皮的油胞层中，而在其他植物中基本不存在或较少存在。柑橘PMFs，因具备多个甲氧基官能团，表现出较为广泛的生理活性。对其加以开发利用，不仅可以增加柑橘产品的附加值，减少柑橘加工带来的大量柑橘皮渣污染，而且对开发新型的安全有效的天然食品防腐剂和抑菌剂也具有重要的指导意义。本论文主要研究了浙江衢州产椪柑（和阳二号）果皮中的 PMFs的成分和含量，及其对黑曲霉的抑制作用活性，并逐步深入地探讨了其抑制黑曲霉生长的作用机制，为PMFs的进一步开发利用提供了一定的理论依据。通过上述研究，得出以下结论：
　　（1）以浙江衢州产椪柑为原料，对其皮渣中PMFs的种类和含量进行了分析。结果表明，这一品种的椪柑皮中含有7种 PMFs，他们的名称和含量分别是橙黄酮（ sinensetin，缩写为 SIN）0.35±0.02％，五甲氧基黄酮（ pentamethoxyflavone）1.08±0.05%，5,7,8,4’-四甲氧基黄酮（tetramethyl-o-isoscutellarein）1.23±0.03%，5,6,7,4’-四甲氧基黄酮（ tetramethyl-o-scutellarein，缩写为 SCU）1.61±0.05%，川陈皮素（nobiletin，缩写为NOB）20.98±0.07%，5-去甲基川陈皮素（5-Demethylnobiletin，缩写为5-DN）3.52±0.01%和甜橙黄酮（tangeretin，缩写为TAN）33.87±0.04%。
　　（2）测定了PMFs对孢子萌发率、菌落生长速率和菌丝生长速率的影响，以评估PMFs对黑曲霉的抑制活性，同时测得椪柑皮PMFs提取物和标准品TAN对黑曲霉的最低抑菌浓度分别为0.12mg/mL和1.50mg/mL。结果表明，椪柑皮PMFs萃取物可以抑制孢子萌发、并且影响菌丝生长和菌落扩张，对黑曲霉表现出显著的抑制作用。PMFs对黑曲霉的生长抑制作用主要发生在黑曲霉的对数生长后期，不仅对黑曲霉的生长产生抑制，甚至导致黑曲霉的细胞衰亡和瓦解。比较 PMFs混合物和单一的多甲氧基黄酮对黑曲霉的最低抑菌浓度（P<0.0001），认为在对黑曲霉的抑制活性方面，PMFs混合物较单一的多甲氧基黄酮更有效，而可能的原因及作用机理还需进一步的实验探讨。
　　（3）测定了黑曲霉培养基质中 Na、K离子的浓度，相对电导率和水溶性蛋白的含量，并分析了PMFs对麦角固醇和几丁质的合成的影响。结果表明，PMFs与黑曲霉细胞接触可以破坏其膜电位平衡，导致Na、K离子的流动，膜渗透性发生改变，胞内物质包括一些离子和蛋白向胞外渗漏，从而导致胞外水溶性蛋白含量大幅度增加，胞外电导率增加；而这极有可能是由于 PMFs抑制了麦角固醇和几丁质的合成导致细胞壁和细胞膜的合成受阻而引起的。这说明 PMFs不仅可以影响天然屏障细胞壁和细胞膜的功能，对其合成也有一定的抑制作用。
　　（4）同时利用溶解氧试剂盒和高效液相色谱（ high performance liquid chromatography，缩写为HPLC）的方法测定了PMFs对黑曲霉细胞的呼吸作用的影响，研究发现 PMFs仅表现出对磷酸钠的抑制作用具有增效作用，而对丙二酸和碘乙酸的抑制无增效作用。磷酸钠是磷酸戊糖途径（Hexosemonophosphate，缩写为HMP）的代谢抑制物，PMFs对其抑制作用的协同效应表明 PMFs与磷酸钠可能不同时作用于同一代谢途径，即对黑曲霉的 HMP途径可能不具有抑制作用，而对碘乙酸和丙二酸抑制的糖酵解途径（Embden-Meyerhof-Parnas，缩写为 EMP）和三羧酸循环途径（Tricarboxylic acid cycle，缩写为TCA）代谢途径有抑制作用，抑制一种途径或对两种代谢途径都有影响。另外 PMFs对黑曲霉菌落生长速率的抑制作用因ATP浓度的增加而减小，表明PMFs对黑曲霉的能量系统也是有所损害的。
　　（5）提取黑曲霉细胞中总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，缩写为DNA），研究 PMFs与黑曲霉总DNA的结合特性，发现PMFs不能直接与黑曲霉总DNA结合或影响其结构特性。该结果表明，PMFs对黑曲霉的抑制作用可能与其遗传物质关系不大，或者抑制作用不是直接发生在改变DNA结构或抑制遗传物质等方面。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1引言

2多甲氧基黄酮研究进展

2.1柑橘皮资源分析

2.2多甲氧基黄酮的来源和分布

2.3 PMFs的性质

2.4 PMFs的生理功能

3抑菌活性和机理研究方法

3.1抑菌活性的研究方法

3.2抑菌机理的研究

4本论文的研究目的和意义

5主要研究内容及创新点

第二章 椪柑皮中多甲氧基黄酮的提取及成分分析

1引言

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1椪柑皮萃取物HPLC分析

3.2椪柑皮中PMFs的成分分析

4讨论

第三章 椪柑多甲氧基黄酮对黑曲霉的抑制活性

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1 椪柑皮中多甲氧基黄酮对黑曲霉菌落形态及生长速率的影响

3.2椪柑皮中多甲氧基黄酮对黑曲霉的生长抑制作用

3.3椪柑皮中多甲氧基黄酮和TAN最低抑菌浓度的测定

3.4椪柑PMFs对黑曲霉孢子萌发的影响

3.5 pH值对PMFs的抑制作用的影响

3.6 ATP对PMFs的抑制作用的影响

4讨论

第四章 椪柑多甲氧基黄酮对黑曲霉的抑制作用机理

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 PMFs对黑曲霉生理屏障的影响

3.2 PMFs对黑曲霉代谢途径的影响

3.3 PMFs对黑曲霉总DNA的作用

4讨论

第五章 结论及展望

1本论文主要结论

2展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章