稻纵卷叶螟信息素结合蛋白基因的克隆与分析

摘要

灵敏的嗅觉在昆虫的寄主定位、觅食、寻找庇护所、求偶、产卵以及躲避天敌和其它危险等过程中起着重要的功能。稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenée)是一种水稻上重要的迁飞性害虫，其幼虫具有卷苞危害的习性，化学防治成本较高，且易对环境产生污染。有研究表明，稻纵卷叶螟雌蛾以释放的性信息素混合物来吸引远距离的雄蛾，雄蛾对此物质表现出极其的敏感性和选择性，但目前关于稻纵卷叶螟嗅觉感受的分子机制并不清楚。因此，本课题以稻纵卷叶螟为研究对象，在对其信息素结合蛋白(pheromone binding proteins，PBPs)基因克隆的基础上，对PBPs基因的表达模式及与气味分子的结合特性进行了分析，以期为明确稻纵卷叶螟嗅觉感受机制以及进一步开发高效诱剂提供理论基础。本文的主要研究结果如下：
　　 ⑴稻纵卷叶螟信息素结合蛋白基因的克隆和序列分析。利用RT-PCR和RACE技术克隆得到了稻纵卷叶螟3个PBPs基因全长，CmedPBP2、CmedPBP3和CmedPBP4（GenBank登录号分别为KC507181、KC507184和KC507185），其开放阅读框全长分别为495bp、549bp和444bp，编码164、182和147个氨基酸。CmedPBP2和CmedPBP3预测N-末端分别包含21和22个氨基酸组成的信号肽序列，而CmedPBP4没有信号肽。这3个基因编码的氨基酸序列和其它鳞翅目螟蛾科昆虫PBPs比对同源性较高(46.13％)，但是这三者之间的同源性较低，只有22.76％，说明它们属于不同的PBPs亚群。
　　 ⑵稻纵卷叶螟信息素结合蛋白基因的时空表达谱研究。荧光定量PCR结果表明，CmedPBPs基因在蛹期表达量很低，主要表达于成虫的触角，其余各部位（头（无触角）、胸、腹、足、翅）的表达量均很低。3个基因在雄蛾触角中的表达量较高，尤其是CmedPBP2，高表达于雄蛾触角（0d时雄蛾触角的表达量大约是雌蛾的95倍）。这3个基因在不同日龄雄蛾触角中的表达量均为0d和3d较高，1d较低(P＜0.05)。在雌蛾触角中的表达量也受日龄的影响，CmedPBP2、CmedPBP3和CmedPBP4分别在1d、0d和5d达到最大值，然而雌蛾交配与否对这3个基因的表达量均无影响。
　　 ⑶稻纵卷叶螟信息素结合蛋白的原核表达、蛋白纯化及荧光结合特性分析。利用基因重组的方法将这3个基因构建到原核表达载体pGEX-6p-1、pET-28a(+)和pET-22b(+)中，其中只有pET-22b(+)-CmedPBP4在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中成功表达，并且主要以包涵体形式存在。通过包涵体变性和复性，经DE52阴离子交换柱一步法纯化得到纯度较高的重组蛋白。
　　 ⑷利用荧光竞争结合试验研究CmedPBP4与32种水稻挥发物的结合特性，以1-NPN为探针，筛选出了10种与CmedPBP4有结合能力的气味物质，结合能力由强到弱依次是:(-)-反式石竹烯、(Z)-法尼烯、（-）-α-雪松烯、α-蒎烯、紫罗兰酮、香叶烯、柏木脑（解离常数均在20以内），橙花叔醇、γ-异松油烯和柠檬烯（解离常数大于20），说明CmedPBP4可能具有普通气味结合蛋白的功能。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 稻纵卷叶螟研究概况

1．2 昆虫的嗅觉

1．2．1 昆虫的嗅觉感器结构及感受机制

1．2．2 昆虫的嗅觉感器类型及功能

1．3 气味结合蛋白研究进展

1．3．1 气味结合蛋白的种类和特征

1．3．2 气味结合蛋白的分布

1．3．3 气味结合蛋白的功能

1．4 研究目的和意义

第二章 稻纵卷叶螟PBPs基因的克隆及序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 主要试剂及试剂盒

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 RACE扩增PBPs基因全长

2．1．5 稻纵卷叶螟PBPs基因的克隆

2．2 结果与分析

2．2．1 稻纵卷叶螟总RNA的提取质量检测

2．2．2 稻纵卷叶螟PBPs基因RT-PCR扩增结果

2．2．3 稻纵卷叶螟PBPs基因克隆的测序结果

2．2．4 稻纵卷叶螟PBPs基因的序列分析

2．3 讨论

第三章 稻纵卷叶螟PBPs基因的时空表达分析

3．1 材料和方法

3．1．1 各部位样品

3．1．2 主要试剂和仪器

3．1．3 样品RNA的提取

3．1．4 cDNA第一条链的合成

3．1．5 引物设计

3．1．6 PCR反应步骤

3．1．7 数据分析

3．2 结果和分析

3．2．1 引物特异性检测

3．2．2 CmedPBPs基因的时空表达结果与分析

3．3 讨论

第四章 稻纵卷叶螟PBPs的表达纯化以及荧光结合特性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 主要菌株、试剂及试剂盒

4．1．2 荧光结合气味物质

4．1．3 主要仪器

4．1．4 质粒的提取

4．1．5 构建原核表达载体

4．1．6 目的蛋白的小量试表达

4．1．7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

4．1．8 靶蛋白的大量表达

4．1．9 包涵体蛋白的变性和复性

4．1．10 靶蛋白的纯化

4．1．11 蛋白浓度的测定

4．1．12 荧光探针适合性测定

4．1．13 荧光竞争结合试验

4．1．14 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 重组质粒的构建

4．2．2 靶蛋白的表达

4．2．3 pET-22b(+)-CmedPBP4蛋白的纯化

4．2．4 蛋白浓度的测定

4．2．5 荧光探针适合性检验

4．2．6 气味分子与CmedPBP4蛋白的结合能力

4．3 讨论

第五章 结语

5．1 主要结果

5．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢