油菜叶片组织培养体系建立及叶绿体表达载体的构建

摘要

油菜是世界上重要的油料作物之一，通过基因工程手段改良油菜农艺性状和创制油菜新种质，对培育油菜新品种具有重要意义。一套高效的组织培养体系是植物基因工程技术能够成功应用的重要前提和基础，本研究以2个甘蓝型油菜品系的子叶和叶片为外植体，研究影响外植体再生的因素，为转化筛选培养体系建立基础;植物表达载体直接关系到外源基因的转化效率、表达情况和遗传稳定性，以及转基因植物的安全性等问题，因此，表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位，也是获得有应用价值转基因植株的基础。
　　 本研究通过扩增外源重组片段，构建油菜叶绿体转化表达载体，为后续研究提供资料。主要研究内容包括：⑴筛选适合叶绿体转化外植体的基因型。比较F4和T15两个品系子叶的组织培养特性及愈伤诱导率、褐化率和成苗率。两个品系愈伤诱导差异不显著，相同培养条件下F4成苗率高于T15; F4的愈伤颜色较绿、致密，具有较强的分化能力。F4比T15更适合作为转化筛选的外植体供试品系。⑵油菜再生体系的建立。以F4和T15的子叶以及F4叶片为材料，分析了影响油菜离体培养的关键因素。研究表明：①最佳分化培养基为MS+4 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA，成苗率最高可达28.1％；②F4品系四种不同苗龄叶片的状态相比较，第22 d叶片的愈伤诱导状态最好；③生根培养基为1/2 MS+1 mg/L IBA，生根率可达100％，此生根培养基生根时间快，根系发达。⑶构建油菜叶绿体表达载体。本研究中，同源重组片段为rbcL和accD，将外源基因EPSPS、筛选标记基因aadA以多顺反子的形式构建在同一个表达框中，这两个基因使用一套启动子和终止子。启动子为16SrRNA Prrn，终止子为Tpsb，均来自于烟草，aadA由叶绿体启动表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究背景

1．2 植物细胞的全能性

1．2．1 离体条件下细胞脱分化

1．2．2 离体条件下的器官发生

1．2．3 影响离体培养的因素

1．3 影响油菜再生体系的因素

1．3．1 培养基激素比例

1．3．2 培养基中AgNO3的作用

1．3．3 玻璃化现象影响外植体再生

1．3．4 不同基因型对再生的影响

1．3．5 不同外植体对再生的影响

1．3．6 预培养时间对再生的影响

1．3．7 基本培养基对组织培养的影响

1．3．8 外植体褐化

1．4 叶绿体表达载体构建和叶绿体基因工程研究

1．4．1 叶绿体表达载体的构建

1．4．2 目的基因整合到叶绿体基因组及其表达

1．4．3 叶绿体转化技术的研究进展

1．5 研究目的和意义

2 油菜组织培养体系的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂和培养基

2．1．3 实验方法

2．1．4 试验统计方法

2．2 结果与分析

2．2．1 萌发培养基

2．2．2 F4和T15子叶再生比较

2．2．3 子叶不同部位愈伤诱导比较

2．2．4 六种愈伤诱导培养基比较

2．2．5 九种分化培养基比较

2．2．6 不同苗龄叶片愈伤组织状态比较

2．2．7 生根培养基比较

3 油菜叶绿体表达载体的构建

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 常用试剂和培养基

3．2 油莱叶绿体表达载体构建

3．2．1 提取质粒DNA

3．2．2 感受态细胞的制备及转化

3．2．3 PCR克隆基因

3．3 结果与分析

3．3．1 同源重组片段的克隆与分析

3．3．2 载体突变位点的修复

3．3．3 油菜叶绿体表达载体的构建过程

4 讨论

4．1 油菜再生体系的建立

4．2 油菜叶绿体表达载体构建

参考文献

致谢