5-氮-2-脱氧胞苷和丁酸钠对水牛供体细胞生长、周期、凋亡及克隆胚胎发育的影响

摘要

体细胞核移植技术对于体外胚胎的生产具有重要的意义，但是体细胞核移植成功率非常低，影响了该技术的实际应用。目前认为体细胞核移植效率低的主要原因是供体细胞的不完全重编程。科学家们已经尝试使用DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理核移植供体细胞或胚胎，从而提高表观遗传重编程的程度。本试验用DNA甲基化酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-dC)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(Sodium butyrate，NaBu)处理水牛成纤维细胞，检测细胞形态、生长、周期和凋亡等，并移植到黄牛卵母细胞中，观察胚胎发育情况，从而筛选两种试剂处理供体细胞的最佳处理方式，得到如下结果与结论:
　　 1.不同浓度的NaBu对水牛成纤维细胞形态、生长、细胞周期和凋亡的影响
　　 用0、0.5、1.0、2.0、2.5和3.0 mmol/L NaBu处理水牛成纤维细胞，检测细胞形态、生长、周期和凋亡，确定处理细胞的最佳浓度。结果显示:0.5和1.0mmol/L NaBu处理的细胞形态正常，2.0、2.5和3.0mmol/L NaBu处理的细胞变大变长，并出现大量死亡;随着NaBu浓度的升高，对细胞生长抑制作用增强，0.5mmol/L NaBu处理48h后的细胞抑制率与对照组无显著差异(2.75对0，P＞0.05)，其他浓度的均有显著性差异(P＜0.05);0.5mmol/L和1.0mmol/L NaBu处理细胞的G0/G1期和S期细胞比例与对照组无显著性差异（P＞0.05），2.0、2.5、3.0mmol/L处理的G0/G1期和S期细胞比例有显著性差异(P＜0.05);0.5 mmol/L和1.0mmol/LNaBu处理的早期凋亡与对照组无显著差异(P＞0.05)，2.0、2.5、3.0mmol/L处理与对照组差异显著(P＜0.05);0.5mmol/L NaBu处理的晚期凋亡与对照组无显著差异(P＞0.05)，其他组均与对照组有显著差异(P＜0.05）。从结果可知:0.5mmol/L和1.0mmol/L NaBu对细胞形态、生长、周期和凋亡影响较小，适合作为处理供体细胞的浓度。
　　 2.5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞生长、周期和凋亡的影响
　　 根据本课题组前期的试验结果，选择0.01μmol/L5-aza-dC处理水牛成纤维细胞72h，1.0mmol/L NaBu处理48h和两种试剂联合处理，检测细胞生长、周期和凋亡。结果显示:联合处理比单独使用5-aza-dC、NaBu以及对照组对细胞抑制作用显著增强(P＜0.05);5-aza-dC对细胞周期无明显影响，NaBu和联合处理可使细胞显著阻滞于G0/G1期（P＜0.05）;联合处理的正常细胞数比5-aza-dC和对照组处理均显著减少(P＜0.05)，而与NaBu组无显著差异(P＞0.05)，联合处理晚期凋亡比5-aza-dC、NaBu以及对照组显著增加(P＜0.05)，各试验组早期凋亡无显著差异。以上结果说明了联合处理组能够显著影响细胞生长、周期和凋亡。
　　 3.5-aza-dC和NaBu处理供体细胞对水牛-黄牛异种核移植胚胎的影响
　　 用0.01 mol/L5-aza-dC处理水牛成纤维细胞72h，1.0mmol/L NaBu处理48h，和两种试剂联合处理的细胞进行水牛-黄牛异种核移植，并以未处理组及同种核移植作对照。结果显示:水牛-黄牛异种体细胞核移植胚胎的2-细胞，8-16-细胞及囊胚发育率均显著低于同种体细胞核移植胚胎(P＜0.05);1.0mmol/L NaBu处理的细胞作为供体细胞进行水牛-黄牛异种体细胞核移植，8-16-细胞和囊胚发育率均显著高于对照组(P＜0.05);5-aza-dC和NaBu联合处理供体细胞得到的水牛-黄牛异种核移植胚胎8-16-细胞发育率显著高于对照组(P＜0.05)，囊胚率显著高于对照组和单独处理组(P＜0.05)。以上结果说明了异种核移植胚胎发育率低于同种核移植胚胎;NaBu处理供体细胞能够显著提高克隆胚胎的体外发育;5-aza-dC和NaBu联合处理能够显著提高克隆胚胎的发育率。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 哺乳动物体细胞核移植研究进展

1．1 异种克隆研究进展

2 影响核移植效率的因素

2．1 供体细胞的选择

2．2 供体细胞的周期状态

2．3 供体细胞的细胞系

3 体细胞核移植表观遗传修饰研究进展

3．1 DNA甲基化

3．2 组蛋白乙酰化

3．3 X染色体失活

3．4 基因组印记

3．5 端粒和端粒酶

4 DNA甲基化与体细胞核移植

4．1 DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dC

5 组蛋白乙酰化与体细胞核移植

6 研究目的与意义

第二章 丁酸钠(NaBu)对供体细胞形态、生长、周期和凋亡的影响

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三章 5-aza-dC和NaBu联合处理对供体细胞生长、周期、凋亡及克隆胚胎发育的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方案与方法

1．3 试验数据统计分析

2 结果与分析

2．1 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞生长的影响

2．2 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞生长抑制率的影响

2．3 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞周期的影响

2．4 5-aza-dC和NaBu联合处理对水牛成纤维细胞凋亡的影响

2．5 5-aza-dC和NaBu联合处理供体细胞对水牛-黄牛异种核移植胚胎发育的影响

3 讨论

3．1 5-aza-dC和NaBu联合处理水牛成纤维细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的影响

3．2 异种与同种体细胞核移植胚胎发育

3．3 NaBu对体细胞核移植胚胎发育的影响

3．4 5-aza-dC和NaBu联合处理供体细胞对核移植胚胎发育的影响

4 小结

总结

参考文献

附图

致谢