猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定及双基因缺失突变株构建

摘要

大肠埃希氏菌(Escherichia Coli，E.Coli)通常称为大肠杆菌，学术界根据其临床致病性将其分为三类:共生型大肠杆菌，肠内致病性大肠杆菌，肠外致病性大肠杆菌。共生型大肠杆菌与宿主是互利共生的关系，并伴随其终生，经粪便散播到周围环境中，一般不致病;肠内致病性大肠杆菌广泛存在于少数宿主的肠道内和环境中，机体免疫功能正常时一般不会引起肠道外的感染，但免疫力低下时会出现肠道外的感染;肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia Coli,ExPEC)可使不同的宿主发生泌尿道感染(UPEC)、脑膜炎(NMEC)、败血症(Septicemia)、肺炎(Pneumonia)、腹膜炎(Pleurisy)及其它肠外软组织感染(Soft Tissue Infections)，因此受到医学界普遍关注，ExPEC与其他病菌的混合感染，给养殖业造成了巨大的经济损失。基于以上所述肠外致病性大肠杆菌的危害我们开展了本实验，旨在通过对临床分离的肠外致病性大肠杆菌进行研究，掌握ExPEC的流行病学规律，为该病的诊断与防治打下基础;另外开展了猪源肠外致病性大肠杆菌ΔkpsM-ΔiucB双基因缺失菌株构建及疫苗的研制工作，希望得到有效控制ExPEC的方法。
　　 本研究主要内容包括：⑴选取病猪肺脏、肝脏、脾脏、脑、气管、关节部位的病料，进行分离培养、PCR鉴定试验，得到50株猪肠外致病性大肠杆菌，并对这些菌进行了毒力基因扩增，遗传群系鉴定、药敏实验。结果表明，所分离出的肠外致病性大肠杆菌均具有2个及以上毒力基因，遗传群系以A、B1群系为主，敏感药物有头孢他啶、头孢噻肟等头孢类药物，但是临床上起作用的药物非常有限，耐药现状严重。⑵以本实验室成功构建的猪源肠外致病性大肠杆菌强毒株PCN033单基因缺失菌ΔkpsM为受体菌，缺失肠外致病性大肠杆菌PCN033iucB基因菌株为供体菌进行接合转移，构建不含抗性的猪源肠外致病性大肠杆菌ΔkpsM-ΔiucB的双基因缺失突变株，并对其生物学特性和毒力进行了研究。测定猪源肠外致病性大肠杆菌亲本菌PCN033和ΔkpsM-ΔiucB双基因缺失菌株在昆明小鼠体内的毒力，计算LD50的值。结果显示，与猪源肠外致病性大肠杆菌亲本菌PCN033比较，双基因缺失株ΔkpsM-ΔiucB的毒力降低了约148倍。这就为临床上研制肠外致病性大肠杆菌新型疫苗奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略词表(abbreviation)

1 文献综述

1．1 大肠杆菌危害

1．2 大肠杆菌病原学

1．2．1 生理生化特性

1．2．2 流行病学

1．3 大肠杆菌致病机制

1．4 大肠杆菌防治

1．4．1 药物防治

1．4．2 疫苗防治

2 研究目的与意义

3 材料及方法

3．1 实验材料

3．1．1 病料、菌株和培养条件

3．1．2 试剂及主要仪器

3．1．3 培养基及主要溶液的配制

3．1．4 试验动物

3．2 实验方法

3．2．1 分菌鉴定

3．2．2 基因工程疫苗的研制

4 结果与分析

4．1 分离鉴定试验结果

4．1．1 培养特性

4．1．2 PCR鉴定结果

4．1．3 毒力基因检测

4．1．4 PCR分群试验结果

4．1．5 药物敏感试验结果

4．2 重组自杀性质粒pRE△iucb的构建

4．2．1 iucB基因上下游片段的扩增

4．2．2 质粒pSK△iucB的构建

4．2．3 质粒pRE△iucB的构建

4．3 缺失株的筛选和鉴定

4．4 突变株生长特性的研究

4．5 缺失菌株对小鼠的毒力试验及LD50的测定

5 讨论

5．1 ExPEC流行病学

5．1．1 流行规律

5．1．2 PCR分群

5．1．3 药敏试验

5．2 ExPEC双基因缺失株的构建

5．2．1 基因工程疫苗

5．2．2 靶位基因的选择

5．2．3 重组自杀性质粒的构建

5．2．4 基因缺失株的筛选鉴定

5．2．5 基因缺失株的生物学培养特性

5．2．6 展望

6 结论

参考文献

致谢