三种主要犬呼吸道病毒多重PCR方法的建立和应用

摘要

犬类常见呼吸道疾病多发于春，秋，冬三季，夏季相对较少。临床上犬呼吸道疾病主要由病毒引起，特别是犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)，犬副流感病毒（canine parainfluenza virus，CPIV）和犬腺病毒Ⅱ型(canine adenovirus type-2，CAV-2)。已有不少研究者从不同角度用PCR方法对其进行单一或与其他病毒联合研究，本文主要针对此三种病毒建立多重PCR诊断方法。
　　 根据GeneBank上发布的CDV、CPIV和CAV-2完整的基因组，分别用NCBI的BLAST同源性分析对基因组进行保守性分析，获得各自的保守区序列:CDV中F基因序列的470～1989bp、CPIV中N基因序列的0～1658bp和CAV-2中全序列的25635～26230bp。本文采用Trizol方法同时提取含CDV、CPIV和CAV-2的阳性样本中的RNA和DNA，将RNA反转录成的cDNA与DNA等浓度等比例混合作为PCR体系的阳性模板。根据病毒保守序列设计引物，通过实验选择最佳的引物组合对。将PCR反应体系及反应程序进行优化，建立同时扩增CDV(500bp)、CPIV(293bp)和CAV-2(655bp)的多重PCR方法。取临床上PCR检测为阳性的病料核酸进行敏感性试验和特异性试验，证明此方法在临床检测中具有高度特异性和敏感性。
　　 在临床上随机收集39例呼吸道病犬的47份病料，用本文建立的多重PCR方法进行检测，得到CDV阳性率为20.5％，CPIV和CAV-2阳性率均为5.13％。对阳性病例样本扩增产物测序，与设计引物所用的病毒保守序列对比分析。用t检验和fisher精确检验对CDV的PCR检测与胶体金检测进行统计分析，结果显示PCR检出率与胶体金检出率具有显著性差异，PCR检出为CDV阳性病例的死亡率与胶体金检测为CDV阳性病例的死亡率也具有显著性差异。
　　 PCR方法是从核酸角度对病毒进行验证，是近些年新出现适用于临床的一种分子生物学技术，检测效率高，病料选择范围广，不存在假阳性。而常规的CDV胶体金测试条方法是从核衣壳上抗原角度进行验证，操作较为快速、简便，但易出现假阳性和弱阳性。因此，将两种检测方法结合应用可以大大提高临床检测此三种呼吸道病毒的确诊率。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究背景

1．2 文献综述

1．2．1 犬瘟热病原、临床表现及诊断

1．2．2 犬副流感病原及临床表现

1．2．3 犬腺病毒Ⅱ型病原及临床表现

1．2．4 PCR技术的应用

1．3 本课题研究思路

1．4 研究内容和目标

1．4．1 研究内容

1．4．2 研究目标

2．材料和方法

2．1 病毒株

2．2 主要试剂

2．3 要仪器和设备

2．4 主要溶液和试剂配制

2．5 阳性样本核酸的提取与保存

2．5．1 病毒总RNA的提取

2．5．2 病毒总DNA的提取

2．5．3 核酸纯度和浓度的测试

2．5．4 总RNA的反转录反应

2．6 多重PCR方法的建立和优化

2．6．1 多重PCR引物设计

2．6．2 多重PCR方法的建立和优化

2．7 多重PCR方法的特异性实验

2．8 多重PCR方法的敏感性实验

2．9 多重PCR方法的临床验证

2．10 呼吸道病犬CDV的PCR和胶体金检测比较

2．11 统计分析

3．结果与分析

3．1 多重PCR方法的建立和优化

3．1．1 多重PCR方法的建立

3．1．2 多重PCR方法的优化

3．2 多重PCR方法的特异性分析

3．3 多重PCR方法的敏感性检测

3．4 多重PCR方法临床验证

3．5 CDV的PCR和胶体金检测

3．5．1 临床病例中PCR与胶体金检测比较

3．5．2 PCR方法对不同来源病料的CDV检测

3．5．3 PCR阳性病例的临床表现

4 讨论

4．1 临床上PCR方法对病样的选择、保存与检测

4．1．1 临床病样的选择

4．1．2 临床病样的采集与保存

4．1．3 临床病样的提取与检测

4．2 PCR方法的特异性和敏感性

4．3 PCR方法在犬呼吸道疾病中的临床应用

4．4 多重PCR技术的优越性和不足之处

4．5 PCR检测CDV检出率比胶体金检出率低的原因

5．结论

参考文献

致谢

附录

附录Ⅰ---研究生简介

附录Ⅱ---39份样本详细信息

附录Ⅲ--设计引物所用基因序列