香蕉枯萎病拮抗菌C10-1的鉴定及生防潜力评价

摘要

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC)引起的一种世界性香蕉真菌毁灭性土传病害，在我国和世界其他香蕉种植区均有分布，目前尚无有效的防治方法，香蕉产业面临极大的威胁。为探索香蕉枯萎病的微生物防治方法，本论文开展了生防芽胞杆菌的分离、筛选和标记、定殖潜力分析以及盆栽防治效果等方面的研究，主要内容和结果如下:
　　 (1)采用平板对峙法从实验室所保存的80株细菌中初筛获得30株拮抗香蕉枯萎病菌FOC4的细菌，经复筛选出10株拮抗效果良好的菌株，进一步通过壳聚糖透明圈法从中选出3株产生壳聚糖降解酶能力较高的菌株。综合这3株菌株的拮抗效果和产壳聚糖降解酶的能力，选出菌株C10-1，其对FOC4菌株B2的抑菌率达58.7％，壳聚糖水解圈宽度为4mm。通过显微镜检观察发现，C10-1菌株发酵液能使病原菌孢子膨大变形，菌丝中间形成大量泡状体。根据菌株C10-1形态和生理生化特性以及16SrDNA序列分析结果，鉴定为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
　　 (2)为了精确地检测C10-1在土壤中的定殖情况，对解淀粉芽胞杆菌C10-1进行抗药性筛选和标记，获得了利福平(Rifampicin，Rif)抗性菌株rC10-1，其在250μg/mL的平板上正常生长，拮抗性能无明显变化。
　　 (3)为验证菌株rC10-1发酵液、菌悬液在土壤中对香蕉枯萎病菌有拮抗效果，分析了标记拮抗菌株rC10-1发酵液、菌悬液在土壤中对香蕉枯萎病菌FOC4的抑制消长动态及rC10-1的存活规律。研究发现拈抗菌rC10-1在自然土和病土中的定殖动态都呈波浪式下降的趋势，接种35d时所有处理土壤中的定殖量趋于稳定水平，由初始菌量3.16×107cfu/g下降到大约为3.0×103cfu/g，拮抗菌可相对稳定地定殖在土壤中;发现FOC4菌株在上述处理土壤中的定殖量下降幅度大于对照（无菌水和LB对照）（存活量相差74倍），病原菌在对照中的消长变化也呈波浪式，拮抗菌rC10-1处理的土壤中病原菌数量初期较大幅度的下降，随着时间的变化有所回升，最后所有处理土壤中的病原菌数量趋于稳定，说明拮抗菌在土壤中有抑制作用且具有一定的周期，且与室内平板抑制实验结果相符。
　　 (4)采用灌根法在盆栽香蕉苗中接种标记菌株rC10-1，检测了rC10-1拮抗菌在香蕉根际、根表、根内及不同土壤深度的分布。发现解淀粉芽胞杆菌C10-1能有效控制香蕉枯萎病的发生，盆栽防效达66.68％，能较好地定殖在香蕉根际、根表、根内，且在自然土和病土处理的土壤中定殖规律相同，在不同深度的土壤层均能检测到拮抗菌的存在，表明该菌既能定殖在根表面，也能向根围扩散。本文通过拮抗对峙和壳聚糖水解平板筛选、抗生素标记、土壤和盆栽防治试验，获得拮抗、产壳聚糖降解酶能力较强和防治效果良好的解淀粉芽胞杆菌C10-1菌株，该菌株在土壤和香蕉苗中具有较好的定殖能力，为将来该菌株的大量发酵及田间防治香蕉枯萎病的应用奠定良好的基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1 文献综述

1．1 香蕉枯萎病发病原因及防治方法

1．2 香蕉枯萎病扩散原因

1．3 香蕉枯萎病病害症状

1．4 香蕉枯萎病菌的防治

1．5 香蕉枯萎病生物防治简介

2 芽胞杆菌的生防作用机制

2．1 竞争作用

2．2 拮抗作用

2．3 诱导植物抗性作用

2．4 促进植物生长

2．5 溶菌作用

2．6 其他

3 根部定殖

3．1 根部定殖研究进展

3．2 植物外围外来微生物定殖的检测方法

3．3 影响引入微生物根部定殖的因素

4 壳聚糖酶简介及应用

5 本课题的研究背景及研究意义

5．1 芽胞杆菌国内外研究现状

5．2 课题研究的目的与意义

第二章 拮抗细菌的筛选

2．1 材料和方法

2．1．1 实验菌株与香蕉品种

2．1．2 供试培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 细菌C10-1、香蕉枯萎病菌的培养及菌悬液的制备

2．2．2 对峙培养抑菌初筛

2．2．3 壳聚糖酶产生菌的筛选

2．2．4 细菌C10-1对香蕉枯萎病菌抑菌活性测定

2．2．5 拮抗菌在5种不同培养基中的生长及抑菌试验

2．2．6 不同浓度C10-1菌悬液抑菌试验

2．2．7 细菌C10-1对香蕉枯萎病菌菌丝生长的抑制作用

2．2．8 细菌C10-1发酵液对香蕉枯萎病菌孢子萌发的抑制作用

2．2．9 芽胞杆菌传代稳定性

2．2．10 芽胞杆菌在不同土壤基质中的生长及活性变化考察

2．3 结果和分析

2．3．1 对峙培养抑菌初筛

2．3．2 壳聚糖酶产生菌的筛选

2．3．2 细菌C10-1对香蕉枯萎病菌抑菌活性测定

2．3．3 拮抗菌在5种不同培养基中的生长及抑菌试验

2．3．4 不同浓度C10-1菌悬液抑菌试验

2．3．5 C10-1对香蕉枯萎病菌菌丝生长的抑制作用

2．3．6 C10-1发酵液对香蕉枯萎病菌孢子萌发的抑制作用

2．3．7 芽胞杆菌传代稳定性

2．3．8 芽胞杆菌在不同土壤基质中的生长及活性变化考察

2．4 讨论

第三章 拮抗菌株C10-1的鉴定

3．1 材料和仪器

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 引物

3．1．4 软件

3．1．5 药品试剂

3．1．6 仪器

3．2 方法

3．2．1 C10-1菌落形态特征观察

3．2．2 C10-1菌株生理生化特性分析

3．2．3 碳源利用(Biolog法)

3．2．4 C10-1菌株16SrDNA序列分析

3．3 结果与分析

3．3．1 C10-1菌株的形态特性

3．3．2 C10-1菌株Biolog(碳源利用)及生理生化特征

3．3．3 拮抗菌株C10-1的16SrDNA序列测定及系统发育树构建

3．4 讨论

第四章 拮抗菌的定殖

4．1 材料和方法

4．1．1 菌株及菌液的准备

4．1．2 试剂及培养基

4．1．3 拮抗菌株抗利福平标记

4．1．4 土壤定殖试验

4．1．5 盆栽防效测定试验

4．1．6 数据统计分析方法

4．2 结果和分析

4．2．1 抗利福平突变株rC10-1的获得

4．2．2 土壤定殖试验

4．2．2 盆栽防效测定试验

4．3 讨论

参考文献

附录

致谢