烟草黑胫病拮抗菌的筛选、鉴定和生防潜力评价

摘要

利用稀释涂布平板法，从黑胫病烟株的根部土壤中筛选获得了3株防治黑胫病的高效拮抗菌XCS007、YBM-4和YJC-4。通过对峙培养法和牛津杯法验证了3株拮抗菌及其粗提物对烟草黑胫病的抑菌效果。探究了3株拮抗菌的最适生长条件（温度、初始pH和培养时间），利用形态学、生理生化特性和16S rDNA序列相似性分析，对3株拮抗菌的系统分类地位进行了鉴定。同时，测定了几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性，在盆栽和大田试验中，调查了XCS007及其粗提物、YBM-4、YJC-4和XCS007+YBM-4+YJC-4混剂（比例1∶1∶1）的防病和控病效果。具体如下: 1.从烟草黑胫病病株根部土壤中筛选获到324株细菌，利用对峙培养法，得到XCS007、YBM-4和YJC-4拮抗菌对烟草黑胫病的相对抑菌率分别达到91.80％、85.34％和72.99％，除有明显的抑菌圈外，黑胫病菌丝边缘处均有明显的溶解现象，抑制菌丝的正常生长和扩展，表明3种拮抗菌具有显著的抑菌效果。通过牛津杯法，XCS007拮抗菌粗提物的抑菌效果最为明显，YBM-4和YJC-4拮抗菌粗提物有一定的抑菌作用。 2.研究发现，XCS007拮抗菌的最适生长温度为30℃，最适pH为7.5，最适培养时间为48h。YBM-4拮抗菌，在32.5℃，pH=7.5条件下，培养60 h，菌株生物量最高。YJC-4拮抗菌最适生长温度为35℃，该温度下培养60h生物量最大，当初始pH=4.5时菌落几乎不生长。 3.XCS007为革兰氏阴性菌，具有运动性，明胶液化明显，产生氧化酶、亚硝酸盐和N2，可以利用柠檬酸盐和分解葡萄糖;V-P和甲基红试验显阴性，不能利用果聚糖和淀粉。当钠盐浓度在3％时，最大生长量为2.11×108 cfu/mL。综合菌株的形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，鉴定XCS007为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。YBM-4为革兰氏阳性菌，V-P测验和甲基红试验显阳性，能利用柠檬酸盐，水解淀粉、葡萄糖，产生亚硝酸盐和N2;氧化酶和明胶液化显阴性，不分解果聚糖。随着钠盐浓度的增加，拮抗菌的生长和繁殖受到明显的抑制。YBM-4与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(KT985478.1)的序列相似性为99％，故YBM-4鉴定为枯草芽孢杆菌。YJC-4为革兰氏阳性菌，在氧化酶、V-P和甲基红检验中显阳性，可以利用柠檬酸盐，分解葡萄糖、果聚糖，产生大量亚硝酸盐和N2;明胶液化显阴性，不能水解淀粉。在2％氯化钠的培养基中，拮抗菌生长量最大，为2.21×109 cfu/mL。YJC-4与沙福芽孢杆菌Bacillussafensis(JF411315.1)的序列相似性为99％，鉴定YJC-4为沙福芽孢杆菌。 4.XCS007拮抗菌产生的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性呈现“先增加后减少”的总体趋势。当拮抗菌培养5d时，几丁质酶活性最高，为1.23 U/mL，当培养6d时，β-1，3-葡聚糖酶活性最高，1.96 U/mL。YJC-4拮抗菌产几丁质酶，在第6d时，酶活性最高为0.67 U/mL，在第4d时，β-1，3-葡聚糖酶活性最高为0.88 U/mL。YBM-4拮抗菌的β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性接近零。 5.盆栽试验中，施药后第7d，7组处理对烟草黑胫病均呈现显著的抑制效果。14d时，XCS007及其粗提物、YBM-4、YJC-4和XCS007+YBM-4+YJC-4混剂（比例1∶1∶1）五个处理的防效分别为77.27％、75.78％、73.03％、78.94％和80.41％。AUDPC分别为75.87、80.65、88.59、72.01、66.98。表明3种拮抗菌混合后，可显著增强对烟草黑胫病的防效，有效延缓和控制烟草黑胫病的危害与扩展。大田试验中，在施药后第10d、20 d、30d进行3次调查发现，58％甲霜·锰锌的防效最佳，其次为XCS007+YBM-4+YJC-4处理，表明拮抗菌混合剂具有潜在的应用和推广价值。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 烟草黑胫病的发生及危害

1．1．1 烟草黑胫病的危害

1．1．2 烟草黑胫病的传播条件与时期

1．1．3 烟草黑胫病的发病症状

1．2 烟草黑胫病的生物防治技术

1．2．1 植物免疫诱抗剂的应用

1．2．2 拮抗微生物的应用

1．2．3 生物有机肥

1．2．4 植物源杀菌剂

1．2．5 基因资源利用

1．3 β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶的研究进展

1．3．3 β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶的协同作用

1．4 研究目的和意义

第二章 烟草黑胫病拮抗菌的分离与筛选

2．1 试验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 拮抗细菌的分离和筛选

2．2．2 拮抗菌对黑胫病菌的拮抗作用

2．2．3 拮抗菌粗提物对黑胫病菌的拮抗作用

2．3．1 拮抗菌的筛选和抑菌效果

2．3．2 拮抗菌的平板抑菌效果

2．3．3 拮抗菌粗提物对黑胫病菌丝的拮抗效果

2．4 讨论

3．1．1 菌种

3．1．2 培养基

3．1．3 试验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 温度对拮抗菌生长量的影响

3．2．2 初始pH对拮抗菌生长量的影响

3．2．3 培养时间对拮抗菌生长量的影响

3．3 结果分析

3．3．1 温度对拮抗菌生长量的影响

3．3．2 初始pH对拮抗菌生长量的影响

3．3．3 培养时间对细菌生长量的影响

3．4 讨论

4．1．1 供试菌种

4．1．2 培养基

4．1．3 试验试剂

4．1．4 试验仪器

4．2 试验方法

4．2．1 烟草黑胫病拮抗菌的形态学

4．2．2 拮抗菌的生理生化特征

4．2．3 拮抗菌的16S rDNA的序列测定

4．3 试验结果

4．3．1 烟草黑胫病拮抗菌的形态学鉴定

4．3．2 拮抗菌的生理生化特征鉴定

4．3．3 拮抗菌的16SrDNA鉴定

4．4 讨论

第五章 烟草黑胫病拮抗菌的酶调控机制研究

5．1 试验材料

5．1．1 供试菌种

5．1．2 培养基

5．1．3 试验试剂

5．1．4 试验仪器

5．2 试验处理

5．2．1 拮抗菌的几丁质酶活性测定

5．2．2 拮抗菌的β-1，3-葡聚糖酶活性测定

5．3 结果与分析

5．3．1 几丁质酶活性的测定

5．3．2 β-1，3-葡聚糖酶活性的测定

5．4 讨论

第六章 烟草黑胫病拮抗菌的防治效果探究

6．1 试验材料

6．2．1 盆栽试验

6．2．2 大田试验

6．2．3 计算公式

6．2．4 数据处理

6．3 试验结果

6．3．1 盆栽试验与示范

6．3．2 大田试验与示范

6．4 讨论

第七章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历