副猪嗜血杆菌毒力因子筛选和capD基因功能研究及致脑膜炎大肠杆菌突破血脑屏障的分子机制研究

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）是定居在猪群上呼吸道的一种革兰氏阴性菌，但在特定的条件下如应激、免疫力低下和混合感染时，毒力菌株可以侵入宿主深部组织引起严重的革拉瑟氏病，主要表现为多发性的浆膜炎、关节炎和脑膜炎，是临床上危害养猪业的重要病原菌之一。对该病原的研究起步晚，且缺乏完善的遗传操作系统，导致目前HPS的毒力因子及其分子致病机制并不十分的清楚，给防制该病以及发展有效的新型疫苗带来了一定的困难。
　　在本实验中，我们从临床上选择了两株HPS分离株（血清5型菌株SH0165和4型菌株7140），并通过动物感染实验证实其在致病力上的显著差异。通过两者基因组间的消减杂交，以及对消减文库的PCR筛选和斑点杂交验证，最终鉴定出了33个在强毒菌株SH0165中存在而在弱毒菌株7140中不存在的差异片段。这33个差异片段依据其对应序列的功能注释可以分为8大类，分别是sclB基因家族，限制修饰系统，噬菌体相关产物，转运系统，外膜蛋白类，代谢，DNA合成以及插入序列。随后，我们对除噬菌体相关片段以外的其他21个差异片段在不同毒力背景的15株HPS参考菌株和42株地方分离株中的流行情况进行了调查并做了统计分析，最终发现，sclB4，sclB7，sclB11，nhaC，ABC-typetransportsystem和fhuA这6个基因在HPS高毒力菌株中的流行情况显著高于它们在HPS低毒力菌株中的流行，提示这些差异基因可能与HPS菌株的致病力存在潜在的关联。
　　结合其他已有的HPS菌株毒力因子筛选的报道，我们选择了HPS菌株的capD基因进行后续基因功能的验证。capD基因编码一种多糖合成蛋白，该蛋白与创伤弧菌的1型荚膜多糖操纵子中的WbfY蛋白具有52％的氨基酸相似性，提示该基因可能与菌株荚膜的生物学功能相关。先前有研究报道，capD基因为HPS强弱毒菌株间的差异基因，在本实验中通过消减杂交并未筛出该基因，但结合其他报道我们在后续的PCR检测中发现该capD基因在强毒株SH0165中存在，而在弱毒株7140中不存在，推测capD基因可能为HPS菌株的一种潜在毒力相关基因，但该基因在致病中的作用并不清楚。本实验中，我们通过构建HPS强毒菌株SH0165的capD基因缺失突变株⊿capD以及互补菌株C-capD，直接证实了该基因与HPS菌株致病力之间的关系。结果表明，(1)capD基因的缺失导致HPS菌株对本动物猪的致病力显著降低，而将该基因互补之后其致病力明显得到提升;(2)野生株SH0165、缺失株⊿capD以及互补菌株C-capD感染实验动物后，野生株SH0165和互补菌株C-capD可以有效地侵入机体各组织造成多系统感染，同时从这些组织中可以成功地分离到细菌，而缺失株⊿capD无法造成多组织的感染，也不能分到菌，提示capD缺失后菌株向组织侵袭力的降低;(3)capD缺失后，HPS菌株对血清中补体介导的杀菌作用的抵抗力完全丧失，而该血清抗性在capD互补之后明显的恢复。综合以上结果表明，capD基因通过影响菌株的血清抗性继而参与菌株的致病过程，为HPS菌株的一种重要的致病因子。然而，本实验中通过透射电镜观察发现capD基因可能仅与荚膜中多糖的结构相关，而与菌株荚膜形成的有无并无直接关联，提示CapD蛋白参与菌株的血清抗性和致病可能与菌株的荚膜关联不大。我们随后通过蛋白质组双向电泳进一步寻找在capD缺失前后菌株蛋白水平上的差异，并鉴定出18个capD基因缺失后上调的蛋白和18个下调的蛋白。后续对这些差异蛋白功能的进一步分析将有助于我们更好地理解CapD蛋白与这些蛋白间可能的互作情况，以及它们与HPS菌株致病力的具体关系。
　　另外，由细菌感染引发的脑膜炎一直是造成高死亡率的重要诱因之一，也是目前临床上急需得到控制的感染病症。HPS感染后的典型特征之一就是脑膜炎的发生，有文献报道，HPS毒力菌株可以有效地穿过脑微血管内皮细胞，继而突破血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)引起脑膜炎。但HPS侵入BBB这一过程的具体分子机制目前完全未知，一些与脑膜炎感染相关的分子靶标尚有待于逐步的发掘。目前国内对于细菌性脑膜炎的研究由于实验平台的不够完善以及脑组织细胞来源受限而未能较好的开展，本研究与国外脑膜炎致病机制研究团队合作，以引发中枢神经系统(CNS)感染最为常见的病原菌大肠杆菌（Escherichiacoli)K1菌株作为代表菌株，探索在致脑膜炎菌株突破BBB致病过程中的重要分子靶标。
　　在本研究中，我们首次直接证明了细胞中的一磷酸鞘氨醇（Sphingosine1-phosphate，S1P）和表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)在致脑膜炎E.coliK1菌株RS218突破BBB过程中的重要功能。RS218菌株感染人脑微血管内皮细胞（HBMEC）可以激活SphK2/S1P/S1P2信号途径，继而引起由HB-EGF介导的EGFR的激活，具体体现在如下:(1)RS218菌株在侵入HBMEC时可以激活EGFR，且EGFR抑制剂gefitinib处理细胞以及通过EGFR显性突变体质粒转染细胞均可以导致菌株侵入水平的显著降低。此外，小鼠经gefitinib给药后可以显著地抑制RS218菌株对脑组织的感染;(2)RS218菌株侵入HBMEC可以激活鞘氨醇激酶SphK2，且利用SphK2抑制剂和S1P的受体拮抗剂阻断细胞S1P信号级联途径可以有效抑制RS218菌株对HBMEC的侵入。同时，小鼠SphK2基因敲除后，感染菌株随血液循环进入脑组织的数量也显著下降;(3)相同的E.coli菌体蛋白OmpA、FimH和N1pI同时参与菌株在感染时对细胞EGFR的激活、S1P的产生以及SphK2的激活;(4)RS218侵入HBMEC过程中，SphK2/S1P/S1P2信号级联途径为EGFR激活的上游信号，且通过HB-EGF介导EGFR的激活;(5)SphK2/S1P/S1P2-EGFR信号途径通过激活c-Src以及后续的ERM蛋白，从而促进菌株突破BBB。以上结果表明，S1P和EGFR在脑膜炎菌株RS218突破BBB引发CNS感染过程中是两种十分关键的分子靶标，细菌通过激活这两种信号分子从而有助于自身的侵入。同时该结果提示，随着临床治疗过程中耐药菌株的大量出现，通过阻断这些致脑膜炎菌株在感染宿主细胞时利用的关键分子将为临床控制脑膜炎的发生和发展提供新的策略。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 副猪嗜血杆菌研究进展

1．1．1 副猪嗜血杆菌病概述

1．1．2 副猪嗜血杆菌的致病机理

1．1．3 HPS潜在致病因子的挖掘与鉴定

1．1．4 小结与展望

1．2 细菌性脑膜炎研究进展

1．2．1 细菌性脑膜炎与血脑屏障

1．2．2 病原菌穿过BBB的基本要素

1．2．3 脑脊液细胞增多及BBB功能的损伤

1．2．4 神经元损伤以及细菌性脑膜炎的临床结果与危害

1．2．5 小结与展望

第2章 副猪嗜血杆菌潜在毒力因子的筛选及capD基因的功能研究

2．1 研究目的与意义

2．2 实验材料

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2 主要试剂及试剂盒

2．2．3 培养基及抗生素溶液的配制

2．2．4 主要溶液及其配制

2．2．5 主要实验器材

2．2．6 实验动物

2．2．7 引物

2．3 实验方法

2．3．1 HPS菌株的复苏和传代培养

2．3．2 HPS血清5型菌株SH0165和4型菌株7140的攻毒试验

2．3．3 SH0165和7140菌株细菌基因组的提取

2．3．4 抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)

2．3．5 消减片段文库的构建和鉴定

2．3．6 Dot-Blot复筛阳性克隆

2．3．7 PCR检测差异片段在HPS参考菌株和地方分离株中的流行

2．3．8 多糖合成基因capD缺失重组质粒的构建

2．3．9 capD基因缺失株的筛选

2．3．10 capD缺失株的PCR鉴定

2．3．11 capD缺失株的Southern鉴定

2．3．12 capD缺失株的RT-PCR鉴定

2．3．13 CapD蛋白的原核表达及纯化

2．3．14 CapD蛋白免疫血清的制备

2．3．15 capD缺失的Western Blotting鉴定

2．3．16 capD缺失的遗传稳定性检测

2．3．17 capD互补菌株的构建

2．3．18 野生、缺失和互补三者菌落形态，生长曲线及生化特性比较

2．3．19 野生株、缺失株和互补菌株三者动物感染实验

2．3．20 野生株、缺失株和互补菌株的血清杀菌实验

2．3．21 野生株和缺失株表面结构的电镜观察

2．3．22 野生株和缺失株的蛋白质组双向电泳

2．4 结果与分析

2．4．1 HPS菌株SH0165和7140的毒力比较

2．4．2 SH0165和7140基因组消减杂交

2．4．3 消减文库的构建和筛选

2．4．4 特异性消减片段的测序分析

2．4．5 消减片段在HPS参考菌株和地方分离株中的流行情况

2．4．6 capD重组质粒的构建与鉴定

2．4．7 SH0165 △capD缺失株的筛选与鉴定

2．4．8 缺失株△capD的DNA、RNA和蛋白水平的验证

2．4．9 互补菌株C-capD的构建及验证

2．4．10 野生株、缺失株和互补菌株的生物学特性

2．4．11 野生株、缺失株和互补菌株三者致病性的比较

2．4．12 野生株、缺失株和互补菌株三者的血清抗性

2．4．13 野生株和缺失株表面荚膜结构的超微切片观察

2．4．14 capD基因缺失前后菌株蛋白质水平上的差异

2．5 讨论

2．5．1 抑制消减杂交筛选的HPS潜在致病相关因子

2．5．2 消减片段在不同背景HPS菌株中的流行情况分析

2．5．3 capD基因功能的初步揭示

2．5．4 CapD蛋白与菌株其他蛋白之间的潜在联系

2．6 小结与展望

第3章 一磷酸鞘氨醇(S1P)和表皮生长因子受体(EGFR)在细菌性脑膜炎中的作用研究

3．1 研究背景

3．2 研究目的与意义

3．3 实验材料

3．3．1 菌株、细胞及质粒

3．3．2 主要试剂及试剂盒

3．3．3 培养基及相关溶液的配制

3．3．4 主要实验器材

3．3．5 实验动物

3．3．6 引物

3．4 实验方法

3．4．1 细菌的粘附侵入实验

3．4．2 HBMEC细胞的转染

3．4．3 免疫沉淀

3．4．4 Western Blotting

3．4．5 荧光定量PCR

3．4．6 小鼠感染实验

3．4．7 统计学分析

3．5 结果与分析

3．5．1 EGFR在致脑膜炎E．coli菌株突破血脑屏障中的作用

3．5．2 激活EGFR的E．coli菌株致病因子的鉴定

3．5．3 S1P和SphK2在致脑膜炎E．coli菌株突破BBB过程中的作用

3．5．4 致脑膜炎菌株RS218侵入HBMEC过程中S1P受体的鉴定

3．5．5 E．coli菌体蛋白OmpA、FimH和NlpI对SphK2的激活作用

3．5．6 致脑膜炎E．coli菌株通过SphK2／S1P／S1P2信号途径激活EGFR

3．5．7 致脑膜炎E．coli菌株对EGFR的激活通过其特异性配体HB-EGF介导

3．5．8 致脑膜炎E．coli菌株感染HBMEC后引起EGFR与c-Src互作

3．5．9 c-Src对RS218菌株侵入HBMEC细胞的影响

3．5．10 SphK2／S1P／S1P2-EGFR信号通路的激活导致后续c-Src的激活

3．5．11 ERM蛋白的激活受到SphK2／S1P／S1P2-EGFR信号通路的调控

3．6 讨论

3．6．1 EGFR在脑血管内皮细胞(BMEC)的表达

3．6．2 EGFR在不同病原菌感染过程中的作用机制

3．6．3 S1P在血管细胞功能中的作用及其对病原菌突破BBB的影响

3．6．4 S1P受体作用的探讨

3．6．5 S1P信号途径激活EGFR的分子机制

3．6．6 c-Src在病原菌感染过程中的作用

3．6．7 ERM蛋白家族与病原菌对宿主细胞侵入的关系

3．7 小结与展望

结论

参考文献

文章发表

致谢