含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法

摘要

本发明公开了提供了一种检测快速方便，实用性强的含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法，并提供了副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原及其编码基因。本发明的有益效果为：①检测过程简便、快速、准确，实用性强，具有较强的推广与应用价值；②敏感性高、特异性强、稳定性好；③用该诊断试剂可以检测副猪嗜血杆菌15血清型的抗体；④安全简便，不需要复杂的检测仪器和设备，检测结果直观。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原及其编码基因，以及含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。 

背景技术

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌( Haemophilus Parasuis , Hps) 引起猪的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病。该病在全世界均有发生，通常见于5-8周龄的猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。近年来此病在规模化猪场的感染率和所致的死亡率日益增高，已为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一。 

副猪嗜血杆菌病是世界性分布的条件性疾病，许多猪场有该病的存在。近年来我国养猪业发展很快，而饲养管理技术水平却相对滞后，饲养环境条件恶劣，疫病日益复杂，猪群健康水平下降，大多处于亚健康状态，这就为本病的发生与流行创造了条件。及时、准确地诊断出该病以便采取相应的措施是成功防制副猪嗜血杆菌病的关键。副猪嗜血杆菌的血清型众多，有15个血清型，还有20%分离株无法分型，所以给副猪嗜血杆菌病的诊断带了很大的困难，尤其是血清学诊断。 

随着分子生物学技术的发展，分子技术在细菌诊断领域广泛的应用，分子诊断在副猪嗜血杆菌的诊断中得到了广泛的应用，如基因限制性片段长度多态性分型（RFLP）技术(de la 2003；del Rio 2006等)、限制性内切酶技术（ERP）(Smart  1988)、肠杆菌基因间保守重复序列（ERIC）(Rafiee 2000)、单基因座序列分型技术和多为点序列分型（MLST）（Olvera 2006），由于这些诊断方法需要专业的设备和技术，所以在临床上很难推广应用。 

Miniats（1991）等用副猪嗜血杆菌的煮沸物或超声波破碎物致敏新鲜绵羊红细胞建立了IHA和用副猪嗜血杆菌的煮沸物或热酚水透析物建立了ELISA诊断方法；石碧（2007）等用副猪嗜血杆菌血清5型荚膜多糖建立了IHA和ELISA诊断方法，检测效果明显优于前者。IHA和ELISA是目前国内外学者探索的主要副猪嗜血杆菌病抗体检测方法，所不同的是抗原的制备方法不同。但是这些诊断方法均具有一定的局限性，全菌超破抗原成分复杂，缺乏特异性，荚膜多糖抗原抗原虽有很好的特异性，但只能检测相应血清型的单一抗体。但在国内，副猪嗜血杆菌流行的血清型比较复杂，主要有血清型4型、5型，12型，13型，其他血清型在临床上偶能发生，所以单一抗体检测试剂不能满足实际生产需要。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种检测快速方便，实用性强的含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原，具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸序列。 

本发明的第二个目的是提供了编码上述副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因。 

进一步的，上述的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因，所述基因具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列。 

本发明的第三个目的是提供了含有基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。 

本发明的第四个目的是提供了表达副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的方法，是将含有上述的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原基因导入宿主细胞，表达得到副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原。 

进一步的，上述的方法，构建所述重组表达载体的出发载体为pET-30a；所述宿主为大肠杆菌BL21。 

本发明的第五个目的是提供了含有上述副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。 

本发明的第六个目的是提供了上述副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂的制备方法，是将表达得到副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白纯化后进行复性，将纯化复性的OppA重组蛋白稀释为6-20mg/ml，之后与等量的5%醛化-鞣酸化绵羊红细胞悬液混合，在37℃水浴中感作30分钟，期间每10分钟振摇一次，离心弃去上清，沉淀用pH7.2，浓度0.1mol/L的PBS悬浮，以3000rpm离心2分钟，洗涤2次；再用含1%灭活健兔血清的PBS悬浮，PBS的pH为7.2，浓度为0.1mol/L，以3000rpm离心2分钟，洗涤1次；最后将沉淀用含1%灭活健兔血清的PBS稀释成1%的致敏红细胞悬液，PBS的pH为7.2，浓度为0.1mol/L，分析检测合格即为副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。 

进一步的，上述副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂的制备方法，纯化后的副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白，其复性过程为，以磷酸盐缓冲液配制的浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L和0mol/L的尿素溶液进行透析复性，尿素溶液pH均为6.0。 

本发明的有益效果为：本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病间接血凝诊断试剂及其制备方法，旨在解决现有技术提供的诊断副猪嗜血杆菌的方法，需专业技术和设备，并且这些诊断方法应用的局限性较大，无法满足副猪嗜血杆菌诊断的最大化需求的问题。诊断试剂由纯化复性的OppA可溶性蛋白致敏醛化-鞣酸化的绵羊红细胞，建立了副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂，诊断试剂根据致敏的红细胞凝集度来确定待检样品中是否存在副猪嗜血杆菌抗体。本发明的优点具体表现在以下几方面：①检测过程简便、快速、准确，实用性强，具有较强的推广与应用价值；②敏感性高、特异性强、稳定性好；③用该诊断试剂可以检测副猪嗜血杆菌15血清型的抗体；④安全简便，不需要复杂的检测仪器和设备，检测结果直观。 

附图说明

图1为本发明载体构建示意图，即载体的物理图谱。 

图2为红细胞凝集结果图片，其中，+：阳性样品；-：阴性样品。 

具体实施方式

实施例1：

1．副猪嗜血杆菌OppA目的基因的获取

1.1 反应体系 

预混酶（宝生物）：12.5 、引物（宝生物）：各1、模板1、无菌双水：9.5；

引物：上游引物5’-ATGCAAACAACCTTTACC-3’

下游引物5’-TTACTGCTTAATGATATA-3’；

1.2 扩增条件

94℃，5min；94℃，50s；51℃，40s；72℃，100s；35个循环。

2.OppA目的蛋白的获取 

2.1将扩增OppA目的基因，与克隆载体pMD19-T连接，转化进大肠杆菌JM109；挑取阳性单克隆菌株，提取质粒；用内切酶EcoR I和XhoI对该质粒和Pet-30a进行双酶切，再用T4连接酶将其连接，然后转化进表达菌株BL21（DE3），以终浓度0.08mmol/L的IPTG进行诱导表达，如图1所示为载体构建示意图。

2.2 诱导后的菌液离心，将沉淀用PBS（pH为6.4，0.1mol/L）重悬，在冰浴中超声波破碎，1000rpm离心10分钟，取上清。上清中的目的蛋白OppA用His-Ni柱进纯化，His-Ni柱来源为Merck(Novagen)，货号70239-3，His·Bind。 

2.3 OppA纯组蛋白的复性，用磷酸盐缓冲液配制的浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L和0mol/L的尿素溶液透析复性，其中不同浓度的尿素溶液pH均为6.0。将复性的目的蛋白浓度稀释至6-20mg/ ml。在0mol/L的尿素中透析2小时，即为复性。 

3．复性的OppA纯组蛋白致敏醛化-鞣酸化红细胞 

将纯化复性的OppA重组蛋白稀释为6~20mg/ml，然后与等量的5%醛化-鞣酸化绵羊红细胞悬液混合（体积比V/V），在37℃水浴中感作30分钟，期间每10分钟振摇一次，离心弃去上清，沉淀用PBS（pH7.2,0.1mol/L）悬浮，以3000rpm离心2分钟，洗涤2次。再用含1%灭活健兔血清（体积比V/V）的PBS（pH7.2,0.1mol/L）悬浮，以3000rpm离心2分钟，洗涤1次。最后将沉淀用用含1%灭活健兔血清的PBS(pH7.2,0.1mol/L）稀释成1%的致敏红细胞悬液，即制成副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂。

4．诊断试剂检测使用方法 

该诊断试剂检测样品，其在96孔V型或96孔U微量医用血凝板上进行，操作步骤包括：

（1）在血凝板 1~12 排的 1~8 孔各加稀释液 25 ；

（2）在血凝板 1~6 列的第 1 孔各加 1 份待检血清25，用排枪依次往下作倍比稀释，直至第 11 排，待检血清的稀释倍数依次为 1 : 2 ~2048；

（3）在血凝板的第 7列的第 1 孔加 25对阳性血清，依次作倍比稀释，直至第 11孔；（4）在血凝板的第8列的第 1 孔加 25标准阴性血清，作倍比稀释至第11孔，第12排的1~8 孔为空白对照；

（5）每孔加入副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂25，将反应板置微型振荡器上震荡1～2分钟，直至血球分布均匀，加入后盖，置37℃作用2～3小时，观察结果。

5.结果判定 

以呈现“＋＋”血凝反应的血清最高稀释度作为间接血凝抗体效价。如图2表示为红细胞凝集结果图片。血凝反应强度表示如下：

“＋＋＋＋”  红细胞全部凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底。

“＋＋＋”    红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者略小。 

“＋＋”      红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状。 

“＋”        红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。 

“±”         红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。 

“－”        红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。 

当阳性对照血清抗体效价≥1∶128、阴性对照血清抗体效价≤1∶2、抗原对照无自凝现象时，试验成立。待检血清抗体效价≥1∶8时，判为阳性；抗体效价≤1∶2时，判为阴性；介于二者之间时，判为可疑。对可疑血清应复检，仍为可疑时，判为阳性。 

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

序列表

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  1638

<212>  DNA

<213>  副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的基因的核苷酸序列

atgcaaacaa cctttacccg ttctttatta gccagtgcga ttgcgcttgg tctttctgtt       60

 

tcggcttttg cagctaaagt gcctgaaggt acggtgcttg cagagaagca agagatcatt      120

 

attaacaata gctcagaacc atcaagtttt gacccacata aaacagaagg tgtgccagaa      180

 

gctcaagttt cttatcagtt acttgaaggt ttagtcacca aagattctgc gggcgaaatc      240

 

attcctggtg tggctgaaac ctggaaaagt tctgatgatt tcaaaacctg gacttttaat      300

 

ttacgcaaaa atgcaaaatg gtctaatggc gaacctgtta ccgcacacga ttttgagttc      360

 

tcgcttaaac gtttaggcga tccgaaaacg gcttcacctt atgcaagtta cttaaactat      420

 

cttcaagttg aaaatgctca agacatcatt gatggtaaaa aagcaccgag tgagttagga      480

 

gttaaagccg ttgatgatta cactttagaa atcaaattaa gcaatcctgt gccttactta      540

 

gtcggtatga tgacgcacca aacgatgttg cctgtgccaa aagcggtcgt tgagaaatta      600

 

ggtgatgcgt gggtgaaaaa agagaactat gtaggtaacg gtgcttataa attagttgag      660

 

catgtgatta atgaaaaaat cgtgtttgaa cgtaacccat tgtattggaa tgataaagaa      720

 

accgtgatta ataaagcgac attcttagct attcaaaatg caagtacaga cgttcaacgt      780

 

tatcgtgcgg gtgacttaca tatcaccagc tacggattgc ctccagagca gttcccgaca      840

 

ttgaaaaaag aaattccaaa tgaagtgttt gtaacccgta cgctttcaac ttactactac      900

 

gagccaaaca acgaaaaagc accatttaac gatgtgcgtg tgcgtaaggc gttaaacttg      960

 

gcattagatc gtagtgtgat tacggataaa gtattagggc aagggcaaac gccaacctat     1020

 

gtgtttacac cgccgtacat tacagaaggt cacttaattc aacaacctga gtactcaaaa     1080

 

caggatatgg catctcgtaa agcagaggcg attaagttgt tagaagaagc tggctttagc     1140

 

aaagcgaacc ctcttaaatt tacgctttta tataacacta acgagaacca taagaaaatt     1200

 

gcgattgcag cacaatcgat cttaaaacaa aacacgggcg gtttagtgga tattaaactt     1260

 

gaaaaccaag agtggaaaac tttcttagat acacgccgtg cgggtaacta tgatgttgca     1320

 

cgtgcaggtt gggcggctga ctataaccaa gcgtcgactt tcggtaaata cttcttgtct     1380

 

aactcaagta acaataccgc tcgttataag agtgcggctt atgatgctga aatcaatgcg     1440

 

gcatataaag cgggtaacgc agaagaacgt gcggcagctt atgcaaaagc ggaagctcag     1500

 

ttagcgaaag attatgcgat cattcctatc tataactatg taaacccacg tttggttaag     1560

 

ccattcgtga aaggttatga gggtaaagat ccgcaggatg atattttatt aagaaacctt     1620

 

tatatcatta agcagtaa                                                   1638

 

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  含有副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的副猪嗜血杆菌病正向间接血凝诊断试剂及其制备方法

 

<210>  2

<211>  545

<212>  PRT

<213>  副猪嗜血杆菌OppA重组蛋白抗原的氨基酸序列

 

 

Met Gln Thr Thr Phe Thr Arg Ser Leu Leu Ala Ser Ala Ile Ala Leu

1                    5                         10                      15      

 

 

Gly Leu Ser Val Ser Ala Phe Ala Ala Lys Val Pro Glu Gly Thr Val

                20                       25                       30         

 

 

Leu Ala Glu Lys Gln Glu Ile Ile Ile Asn Asn Ser Ser Glu Pro Ser

           35                       40                      45              

 

 

Ser Phe Asp Pro His Lys Thr Glu Gly Val Pro Glu Ala Gln Val Ser

     50                        55                       60                 

 

 

Tyr Gln Leu Leu Glu Gly Leu Val Thr Lys Asp Ser Ala Gly Glu Ile

65                        70                        75                       80 

 

 

Ile Pro Gly Val Ala Glu Thr Trp Lys Ser Ser Asp Asp Phe Lys Thr

                    85                        90                       95     

 

 

 

Trp Thr Phe Asn Leu Arg Lys Asn Ala Lys Trp Ser Asn Gly Glu Pro

                100                      105                      110        

 

 

Val Thr Ala His Asp Phe Glu Phe Ser Leu Lys Arg Leu Gly Asp Pro

          115                      120                      125            

 

 

Lys Thr Ala Ser Pro Tyr Ala Ser Tyr Leu Asn Tyr Leu Gln Val Glu

     130                     135                      140                

 

 

Asn Ala Gln Asp Ile Ile Asp Gly Lys Lys Ala Pro Ser Glu Leu Gly

145                      150                     155                      160

 

 

Val Lys Ala Val Asp Asp Tyr Thr Leu Glu Ile Lys Leu Ser Asn Pro

                    165                       170                     175    

 

 

Val Pro Tyr Leu Val Gly Met Met Thr His Gln Thr Met Leu Pro Val

               180                       185                      190        

 

 

Pro Lys Ala Val Val Glu Lys Leu Gly Asp Ala Trp Val Lys Lys Glu

          195                      200                      205            

 

 

Asn Tyr Val Gly Asn Gly Ala Tyr Lys Leu Val Glu His Val Ile Asn

     210                      215                      220                

 

 

Glu Lys Ile Val Phe Glu Arg Asn Pro Leu Tyr Trp Asn Asp Lys Glu

225                     230                       235                      240

 

 

Thr Val Ile Asn Lys Ala Thr Phe Leu Ala Ile Gln Asn Ala Ser Thr

                    245                      250                      255    

 

 

Asp Val Gln Arg Tyr Arg Ala Gly Asp Leu His Ile Thr Ser Tyr Gly

                260                      265                     270        

 

 

Leu Pro Pro Glu Gln Phe Pro Thr Leu Lys Lys Glu Ile Pro Asn Glu

          275                      280                       285            

 

 

Val Phe Val Thr Arg Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr Tyr Glu Pro Asn Asn

     290                      295                     300                

 

 

Glu Lys Ala Pro Phe Asn Asp Val Arg Val Arg Lys Ala Leu Asn Leu

305                      310                      315                      320

 

 

Ala Leu Asp Arg Ser Val Ile Thr Asp Lys Val Leu Gly Gln Gly Gln

                      325                     330                      335    

 

 

Thr Pro Thr Tyr Val Phe Thr Pro Pro Tyr Ile Thr Glu Gly His Leu

                340                     345                     350        

 

 

Ile Gln Gln Pro Glu Tyr Ser Lys Gln Asp Met Ala Ser Arg Lys Ala

          355                     360                       365            

 

 

Glu Ala Ile Lys Leu Leu Glu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Ala Asn Pro

     370                      375                      380                

 

 

Leu Lys Phe Thr Leu Leu Tyr Asn Thr Asn Glu Asn His Lys Lys Ile

385                       390                      395                      400

 

 

Ala Ile Ala Ala Gln Ser Ile Leu Lys Gln Asn Thr Gly Gly Leu Val

                    405                      410                      415    

 

 

Asp Ile Lys Leu Glu Asn Gln Glu Trp Lys Thr Phe Leu Asp Thr Arg

                420                      425                      430        

 

 

Arg Ala Gly Asn Tyr Asp Val Ala Arg Ala Gly Trp Ala Ala Asp Tyr

          435                      440                      445            

 

 

Asn Gln Ala Ser Thr Phe Gly Lys Tyr Phe Leu Ser Asn Ser Ser Asn

      450                     455                      460                

 

 

Asn Thr Ala Arg Tyr Lys Ser Ala Ala Tyr Asp Ala Glu Ile Asn Ala

465                      470                      475                     480

 

 

Ala Tyr Lys Ala Gly Asn Ala Glu Glu Arg Ala Ala Ala Tyr Ala Lys

                     485                      490                      495    

 

 

Ala Glu Ala Gln Leu Ala Lys Asp Tyr Ala Ile Ile Pro Ile Tyr Asn

                500                      505                    510        

 

 

Tyr Val Asn Pro Arg Leu Val Lys Pro Phe Val Lys Gly Tyr Glu Gly

          515                      520                      525            

 

 

Lys Asp Pro Gln Asp Asp Ile Leu Leu Arg Asn Leu Tyr Ile Ile Lys

     530                      535                      540                 

 

 

Gln

545