两个单增李斯特菌分离株的毒力测定和基因组测序及比较基因组学分析

摘要

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenges，Lm)简称单增李斯特菌，是人畜共患病李斯特菌病(listeriosis)的病原菌，是食源性致病菌，易感染免疫力低下者，导致胃肠炎、脑膜炎、败血病和流产等。Lm是兼性胞内菌，可作为研究细胞内感染和细胞免疫的模式细菌，还可作为研制抗胞内感染和肿瘤的疫苗的载体菌株。
　　本研究对来源于食品的两株Lm分离株LM605和LM201进行了毒力的体内外测定、基因组测序和针对毒力基因的比较基因组学分析，拟为以LM605或LM201为出发菌株进行Lm的致病机理的探索和减毒活疫苗载体的研制打基础。
　　1.LM605和LM201的体外毒力测定
　　溶血实验表明，两分离株均可形成较小的β溶血环。细胞粘附侵袭实验表明，两分离株对RAW264.7细胞的粘附侵袭能力显著强于对照菌株L.innocuaLI56(P＜0.01)，LM201的粘附侵袭能力略高于LM605(P＞0.05)。生物被膜(biofilm)形成能力测定结果表明，37℃培养24h，两分离株均具有中等生物被膜形成能力(2ODc＜OD≤4ODc)。
　　2.LM605和LM201的体内毒力测定
　　以5周龄小鼠为实验动物，测定两分离株半数致死量(LD50)，结果表明，LM605的LD50为8.5×107CFU/mL;LM201的为6.3×106CFU/mL，其logLD50＜7，表明LM201属于强毒株。同时，对实验小鼠进行了临床症状、病理解剖学变化和组织病理学变化观察，结果显示，与对照组相比，试验组小鼠在实验期间出现精神沉郁、食欲减退和结膜发炎等症状;剖检结果显示，肺脏有出血点、肝脏出现变性坏死灶和脑膜充血;病理切片观察显示，各组织器官中单核细胞增多并伴有出血和炎症。3.LM605和LM201的基因组测序、拼接和注释通过高通量测序，测得LM605的基因组全长为3，001，147bp(G+C％为37.8％)，编码区大小为2，678，396bp，蛋白编码基因有2948个;LM201的基因组全长为3，200，729bp(G+C％为37.4％)，编码区大小为2，836，379bp，蛋白编码基因有3165个。对蛋白编码基因进行了COG功能分类和预测。
　　4.LM605和LM201的比较基因组学分析
　　(1)基于基因组测序结果，用特异性引物序列对两分离株进行了血清分型，结果显示，其血清型均为4b型。(2)用16SrRNA基因序列构建了进化树，结果显示，两分离株之间的进化距离较近，LM201与Lm菌株F2365和07PF0776的进化距离最近。(3)以LmF2365和LmEDG-e为参考菌株，选取两分离株毒力岛1和毒力岛2的9个毒力基因，分别在氨基酸和核苷酸水平上进行同源性比较，结果显示，9个毒力基因均较保守，但有不同程度的插入、缺失或替换。(4)用9个毒力基因编码蛋白质的氨基酸序列构建了进化树，结果表明，两分离株的进化关系不一致，推测它们具有不同的进化水平。(5)对已报道的60个Lm致病相关基因分别在两分离株中的存在情况进行推测，结果显示，60个基因在LM201中测出57个（存在率为95.0％），其中与细菌粘附侵袭相关的基因auto、inl和gtcA未被测出;60个基因在LM605中测出59个（存在率为98.3％），inl基因未被测出。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 单增李斯特菌简介

1．1．1 生物学特性

1．1．2 血清分型

1．1．3 致病机制

1．1．4 毒力因子

1．2 微生物基因组学研究概述

1．3 微生物比较基因组学研究概述

1．4 单增李斯特菌基因组学研究进展

2 研究目的和意义

3 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 菌种

3．1．2 实验动物和细胞株

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要器材

3．1．5 主要溶液配制

3．1．6 生物信息学分析软件

3．2 方法

3．2．1 LM605和LM201的体外毒力测定

3．2．2 LM605和LM201的体内毒力测定

3．2．3 LM605和LM201的基因组测序、拼接和注释

3．2．4 利用基因组序列进行血清分型

3．2．5 主要毒力基因的序列分析

3．2．6 进化分析

3．2．7 利用基因组序列进行致病相关基因的推测

4 结果与分析

4．1 LM605和LM201的体外毒力测定结果

4．1．1 菌落形态和革兰氏染色特性

4．1．2 溶血性测定结果

4．1．3 生化鉴定结果

4．1．4 生物被膜形成能力的比较结果

4．1．5 LM605和LM201对细胞的粘附侵袭能力测定结果

4．2 LM605和LM201的体内毒力测定结果

4．2．1 小鼠半数致死量(LD50)的测定结果

4．2．2 临床症状

4．2．3 病理解剖学变化

4．2．4 病理组织学变化

4．3 LM605和LM201的基因组测序结果与分析

4．3．1 基因组DNA的提取检测结果

4．3．2 基因组测序、拼接和注释结果

4．4 LM605和LM201的比较基因组学分析

4．4．1 利用基因组序列进行血清分型的结果

4．4．2 16S rRNA系统进化树构建与分析

4．4．3 主要毒力基因的序列分析

4．4．4 主要毒力基因编码的氨基酸序列的分子进化树构建与分析

4．4．5 利用基因组序列进行致病相关基因推测的结果

5 讨论

5．1 单增李斯特菌体内毒力测定分析

5．2 生物被膜(bacteria biofilm)形成能力的分析

5．3 基因组测序

5．4 血清分型

5．5 进化分析

5．6 毒力基因的推测

6 结论

参考文献

致谢

附录