猪弓形虫体内诱导抗原对NF-kB信号通路的影响

摘要

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是由法国学者于1908年发现的能广泛寄生于包括人在内的所有温血动物有核细胞内的一种寄生虫，它能引起严重的人畜共患弓形虫病。人类对弓形虫具有较强的自然免疫能力，免疫功能正常的成年人感染后多呈隐形感染，但是对于一些免疫功能受损、免疫缺陷者或者先天性弓形虫感染者，往往会造成严重的后果，因而弓形虫病的有效防治是极为重要的。弓形虫生活史复杂，包括组织包囊、卵囊、配子体、速殖子和缓殖子等众多发育形式，此外在长期的寄生生活中，弓形虫发展出很多的免疫逃避机制以逃避宿主的免疫攻击。而弓形虫在入侵的过程中，体内诱导抗原会在宿主内大量表达，推测可能是宿主的免疫系统释放了免疫因子刺激其体内诱导抗原的表达。
　　哺乳动物转录因子NF-κB家族是B细胞中κB轻链的调控原件，也是动物主动免疫过程中关键性的调控因子。NF-κB家族的转录调控与炎性反应、细胞凋亡、细胞增殖、分化以及存活都有着一定关联，同时NF-κB信号通路还是宿主免疫系统调控的重要手段。
　　因此体内诱导抗原与NF-κB信号通路极可能有潜在的相互作用。本研究首先将实验室之前的同学已经筛选获得的猪弓形虫体内诱导抗原阳性结果中的部分抗原基因进行体内外表达差异的验证，PCR扩增基因全长的ORF;然后利用双荧光素酶检测方法检测了这些抗原对NF-κB信号通路的激活效应，并在TNF-α刺激下检测了它们对该信号通路的抑制效应。具体工作包括以下几个方面:
　　(1)猪弓形虫体内诱导抗原体内外表达差异的验证及全长ORF的PCR扩增
　　选择本实验室之前的同学筛选得到的14个猪弓形虫体内诱导抗原阳性克隆中的5个功能蛋白，即亮氨酸重复序列(LRL)、钙调蛋白(CaM)、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(D3)、致密颗粒蛋白5(GRA5)、致密颗粒蛋白15(GRA15)，同时包括3个未知功能的假定蛋白，TOX.DB上的编号分别为TGGT1-098800（暂称G1）、TGME49-212160(M4)、TGGT1-059670(JK)，根据各自的ORF设计引物，real-timePCR检测感染弓形虫速殖子72个小时的BALB/c鼠中的虫子和BHK细胞中培养相同时长的弓形虫速殖子中这8个基因mRNA相对表达水平的差异。结果显示，BALB/c鼠体内速殖子内这8个基因中有6个的表达量都显著高于体外BHK中的表达量，统计学分析差异显著(P＜0.05)。另外LRL和M4体内外表达差异并不明显。利用数据库中的基因全长CDS序列设计了真核表达引物，分别克隆这6个基因的ORF片段，连接真核表达载体pCMV-tag2B，构建了带Flag标签的真核表达质粒。
　　(2)猪弓形虫体内外表达差异抗原对NF-κB信号通路激活效应的影响
　　利用双荧光素酶检测方法，验证体内诱导抗原对NF-κB信号通路的影响。利用已经构建好的NF-κB转录的调控元件(启动子或3'UTR)克隆在萤火虫荧光素酶基因的上游，构建荧光素酶报告质粒，使之作为受调控的报告基因，再将海肾荧光素酶基因作为内对照，在细胞中同时转染以上两种质粒，检测NF-κB信号通路的激活。以报道过的弓形虫ME49株(typeⅡ型)的GRA15作为阳性对照，结果显示，体内诱导抗原RH株(typeⅠ型)GRA15有显著的激活NF-κB信号通路的效应。但是随后的NF-κB原件p65的核转移实验未能成功验证这一结果。
　　(3)猪弓形虫体内外表达差异抗原对NF-κB信号通路抑制效应的影响
　　同样利用双荧光素酶检测方法，以NF-κB信号通路的刺激物TNF-α的添加作为激活组，在同样的刺激剂量和时间作用下，观察载体组和体内诱导基因组对NF-κB信号通路抑制效应的影响。通过多次重复实验，相比较载体组均未发现这些基因有抑制NF-κB信号通路的作用。
　　(4)致密颗粒蛋白GRA15(Ⅰ/Ⅱ)免疫原性的研究
　　typeⅠ型和Ⅱ型的GRA15都和免疫相关的NF-κB信号通路有一定关联，我们利用小鼠模型求证了这两个都能激活NF-κB信号通路的基因在BALB/c鼠体内诱导免疫应答的能力。三次免疫后检测了弓形虫全虫裂解抗原刺激抗体产生水平、淋巴细胞增值情况以及IL2、IL4、IL12和IFN-γ的产生情况，虽然结果都呈阴性，但是仍然为探索更为有效的弓形虫疫苗提供一定的理论参考和借鉴。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．文献综述

1．1 弓形虫简介

1．1．1 弓形虫的发现

1．1．2 弓形虫的形态特征及生活史

1．1．3 弓形虫病的危害

1．2 体内诱导抗原技术

1．3 NF-κ B信号通路简介

1．3．1 NF-κ B信号通路概况

1．3．2 NF-κB家族成员简介

1．3．3 NF-κ B信号通路在寄生虫领域的研究概况

1．4 双荧光素酶检测技术概况

1．4．1 双荧光素酶检测的原理

1．4．2 双荧光素酶检测技术的应用

1．5 弓形虫疫苗的研究简介

1．5．1 弓形虫的免疫应答

1．5．2 弓形虫疫苗的研究概况

2 研究目的与意义

3 材料和方法

3．1 试验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 菌株、载体及获赠质粒

3．1．3 虫株和细胞

3．1．4 主要药品及试剂

3．1．5 培养基与抗生素及其配制

3．1．6 缓冲液

3．1．7 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 弓形虫RH株的收集

3．2．2 速殖子总RNA的提取

3．2．3 体内诱导抗原基因表达差异的验证

3．2．4 构建真核表达质粒

3．2．5 体内诱导抗原对NF-κ B信号通路的影响

3．2．6 致密颗粒蛋白GRA15(type Ⅰ／Ⅱ)免疫特性的研究

4 结果与分析

4．1 体内诱导抗原在体内和体外表达差异的Real-time PCR的验证

4．2 体内诱导抗原真核表达重组质粒的构建

4．2．1 体内诱导抗原基因全长ORF的获得

4．2．2 目的基因与克隆载体的连接

4．2．3 重组真核表达质粒的构建

4．3．体内诱导抗原对NF-κ B信号通路的影响

4．3．1 对信号通路激活作用的影响

4．3．2 目标基因对NF-κ B信号通路的抑制试验

4．4 GRA15(Ⅰ／Ⅱ)免疫特性的研究

4．4．1 间接免疫荧光检测重组质粒pCMV-tag／GRA15(Ⅰ／Ⅱ)的体外表达

4．4．2 实验动物血清抗体的检测

4．4．3 淋巴细胞增殖实验

4．4．4 细胞因子的检测

4．4．5 重组质粒pCMV-tag／GRA15(Ⅰ／Ⅱ)对小鼠的保护力检测

5 讨论

5．1 猪弓形虫体内诱导抗原基因的研究

5．2 NF-κ B信号通路的研究

5．2．1 病原体对NF-κ B信号通路的影响

5．2．2 弓形虫对NF-κ B信号通路的影响

5．3 GRA15Ⅰ／Ⅱ)基因免疫特性的研究

6 结论

参考文献

致谢