海洋细菌Zunongwangia sp.两种α-淀粉酶基因的克隆、表达与酶学性质分析

摘要

淀粉是一种重要的工业原料。α-淀粉酶(内切-1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)能够以淀粉为底物，随机水解淀粉分子内部的α-1，4-糖苷键，广泛应用在淀粉加工、食品、造纸、纺织和医药等多个领域，具有重要的经济价值。本研究从海洋细菌Zunongwangia sp.中扩增得到两个新的淀粉酶基因，其中一个为典型的α-淀粉酶，另一个为具有环糊精水解活性的α-淀粉酶;将它们克隆到表达载体pGEX-6P-1上，并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了异源表达;纯化了重组的两个α-淀粉酶，并对其酶学性质进行了研究。获得如下研究成果:
　　具有环糊精水解活性的α-淀粉酶AmyZ1:AmyZ1的基因（amyZ1）全长1848bp，GC含量37.55％，编码一个615个氨基酸的多肽，预测等电点pI为4.65、蛋白分子量71.15kDa。Signal P4.1 Server预测该多肽N-端有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列。成熟的α-淀粉酶由594个氨基酸组成，预测等电点pI和分子量分别为4.60和68.86kDa。序列比对显示，AmyZ1属于糖苷水解酶家族13，与Gillisia sp.CBA3202假设的α-淀粉酶(WP_010227850)有最高的序列一致性(72％);且AmyZ1除具有典型α-淀粉酶的保守序列外，在其N-端和C-端还分别存在着环麦芽糊精酶的保守结构域，与Bacteroides sp.CAG:714的环麦芽糊精酶(WP_022339125)有45％的序列一致性。AmyZ1在35℃和pH7.0时活性最高，在0℃时仍有39％的活性，显示出其冷适应性。AmyZ1表现出极端的耐盐性，在1.5M NaCl时有最大活性（126％相对活性），在4M NaCl时保留有93％的活性。以可溶性淀粉为底物时，AmyZ1的Km和kcat值分别为2.74mgml-1和316.49s-1;而当反应混合液中存在1.5M NaCl时，这两个值分别为2.30mgml-1和329.58s-1，相应地kcat/Km值从115.51mlmg-1s-1增加到143.30mlmg-1s-1。NaCl和CaCl2可显著提高酶的热稳定性:AmyZ1与1.5M的NaCl在35℃下保温120min后，其残余酶活相对于没有NaCl时提高了13.2倍;而1mM CaCl2的存在使其相应酶活提高了11.4倍。底物特异性实验显不，AmyZ1除对可溶性淀粉有最高活性外，也可以降解环糊精，是一个具有环糊精水解活性的α-淀粉酶。
　　α-淀粉酶AmyZ2:AmyZ2的基因（amyZ2）全长1446bp，GC含量38.31％，编码一个481个氨基酸的多肽，预测等电点pI为4.24、蛋白分子量为55.17kDa。Signal P4.1 Server预测该多肽N-端有一个由24个氨基酸组成的信号肽序列。成熟的α-淀粉酶由457个氨基酸组成，预测等电点pI和分子量分别为4.14和52.31kDa。序列比对显示，AmyZ1属于糖苷水解酶家族13，与已报道的Pyrocoocus Woesei的α-淀粉酶(PDBID1MWO)具有最高的序列一致性(45％)。AmyZ2在50℃和pH7.0时活性最高，且在pH10.0和11.0的缓冲液中放置5d后(25℃)，仍分别有143％和126％的相对活性，显示出其较好的碱稳定性。AmyZ2表现出极端的耐盐性，在2M NaCl时有最大活性（138％相对活性），在3.5M NaCl时保留有100％的活性;AmyZ2在0-4M NaCl中相对稳定。NaCl的存在可显著提高酶的热稳定性:AmyZ2与2M的NaCl在50℃下保温3h后，其残余酶活相对于没有NaCl时提高了53.6倍。在以可溶性淀粉为底物时，AmyZ2的Km和kcat值分别为11.71mgml-1和1449.43s-1，kcat/Km值为123.78mlmg-1s-1。AmyZ2对可溶性淀粉的比活力为1662.4U/mg。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviations)

1 前言

1．1 淀粉酶概述

1．1．1 淀粉

1．1．2 淀粉酶

1．1．3 淀粉酶的分类

1．2 α-淀粉酶概述

1．2．1 α-淀粉酶

1．2．2 α-淀粉酶家族

1．2．3 α-淀粉酶的结构特征

1．2．4 α-淀粉酶的催化机理

1．2．5 α-淀粉酶的工业应用

1．3 极端α-淀粉酶概述

1．3．1 低温α-淀粉酶

1．3．2 耐盐α-淀粉酶

1．4 α-淀粉酶的研究进展

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 仪器设备

2．2 α-淀粉酶基因的克隆

2．2．1 扩增α-淀粉酶基因

2．2．2 扩增不含信号肽的α-淀粉酶基因

2．2．3 PCR产物纯化、回收与酶切

2．2．4 酶连与转化

2．2．5 检测阳性克隆子

2．3 α-淀粉酶AmyZ的表达与纯化

2．3．1 α-淀粉酶AmyZ的诱导表达

2．3．2 α-淀粉酶AmyZ的纯化

2．3．3 凝胶电泳和蛋白浓度测定

2．4 α-淀粉酶AmyZ的酶学性质研究

2．4．1 标准曲线的绘镧

2．4．2 α-淀粉酶活性的测定方法

2．4．3 α-淀粉酶的最适pH和pH稳定性

2．4．4 α-淀粉酶的最适温度和热稳定性

2．4．5 NaCl对酶活性、酶稳定性和热稳定的影响

2．4．6 CaCl2对酶活性和热稳定性的影响

2．4．7 金属离子和化学试剂对α-淀粉酶活性的影响

2．4．8 α-淀粉酶的底物特异性

2．4．9 α-淀粉酶动力学参数测定

2．4．10 α-淀粉酶三维结构模拟

3 结果与分析

3．1 Zunongwangia sp．(MCCC 1A01486)总DNA的提取

3．2 α-淀粉酶AmyZ1的研究

3．2．1 α-淀粉酶基因amyZ1的克隆

3．2．2 α-淀粉酶AmyZ1的表达与纯化

3．2．3 α-淀粉酶AmyZ1酶学性质分析

3．3 α-淀粉酶AmyZ2的研究

3．3．1 α-淀粉酶基因amyZ2的克隆

3．3．2 α-淀粉酶AmyZ2的表达与纯化

3．3．3 α-淀粉酶AmyZ2酶学性质分析

4 讨论

4．1 底物特异性差异分析

4．2 AmyZ1的冷活性

4．3 酶的耐盐性

4．4 AmyZ2的碱稳定性

4．5 金属离子的影响

参考文献

附录

1．溶液

2．细菌基因组DNA抽提

3．抽提细菌的质粒DNA

4．大肠杆菌感受态细胞制备

5．凝胶电泳分离蛋白

6．α-淀粉酶AmyZ1核苷酸及氨基酸序列

7．研究成果

致谢