海洋细菌HQM9胞外酶谱分析及其琼胶酶基因的克隆表达

摘要

本实验室从威海海域分离出一株具有很强降解琼胶能力的海洋细菌,编号为HQM9,通过对其基因组进行测序,预测出34条疑似琼胶酶基因序列。本论文选用其中的基因aga16G在大肠杆菌中进行克隆与表达。生物信息学分析结果表明,与其编码的氨基酸序列最相近的序列为Agarivoran.s sp.LQ48的一个p-琼胶酶agaA,相似度仅为47％.根据aga16 G序列，利用软件primer premier5设计特异性引物引物(包括酶切位点和His标签)，扩增目的片段，然后将基因连接到原核表达载体pET24a(+)，构建表达载体pET24a-agal6G，转化大肠杆菌扩增菌株DHS中，提取扩增之后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行表达，经0.1mM的IPTG诱导后检测到菌体内有大量蛋白表达，且发酵上清液中能够检测到琼胶酶活性，证明基因agal6G为琼胶酶基因，综合其序列相似性分析，可以初步确定基因aga16G为新的琼胶酶基因，表达后的重组琼胶酶命名ragal6G，对重组酶的酶学性质进行测定，发现其最适底物浓度1%琼脂糖，最适反应温度为50℃，最适pH为6.0，最适条件下，比酶活可达13.6U/mg。