苎麻试管苗再生体系与根癌农杆菌介导遗传转化体系的优化

摘要

苎麻（Boehmeria nivea(L.) Gaud）为多年生草本韧皮纤维作物；其单纤维长、纤维强度大、吸湿和散湿快，抗菌、热传导性能好，广泛应用于纺织工艺中。苎麻具有抗病虫害、抗旱、耐盐、水土保持等特点，能适应山坡地、丘陵地等复杂的生长环境；在合理有效利用水土资源、保护环境、扩大经济效益方面都具有良好的促进作用。转基因作物研究已经广泛深入的展开；通过导入特异目的基因进行特定性状的变异，可大幅缩短新品种的培育年限。现有的苎麻再生体系研究中，外植体材料主要以种子来源为主，遗传背景复杂使其遗传因素难以稳定。建立试管苗外植体（叶片、茎段、叶柄和中脉）的稳定再生体系具有重要意义。不同品种苎麻间的再生能力差异大，寻找苎麻再生的关键影响因素是打破品种的局限性，也是建立苎麻高效稳定遗传转化受体系统过程中亟需讨论的问题。
　　本研究以苎麻栽培种，“华苎5号”为材料，针对4种无菌苗来源外植体（叶片、茎段、叶柄和中脉）建立了稳定高效的再生体系，对4种外植体的再生发育过程进行了形态学和显微技术方面的研究和分析，结合现阶段分子生物学技术在植物再生上的研究成果，确定了影响苎麻再生发育过程和方式中的关键影响因素。对4种外植体的遗传转化方法进行了系统研究，大幅提高了其遗传转化效率，并建立了苎麻高效稳定的遗传转化体系。主要研究结果如下：
　　1．建立了苎麻茎尖来源无菌苗准备体系。通过1g/L抗坏血酸（Ascorbic acid，简称AA）溶液对茎尖材料进行预处理，使用暗置、冰置和2g/L活性炭（Activated charcoal，简称 AC）溶液暂存等方法，显著降低了苎麻无菌苗准备过程中褐化的发生，有效提高茎尖存活率至67.21%。讨论了6-BA和NAA对苎麻无菌苗快繁的影响，通过MS+1.0mg/L6-BA+0.8g/L Agar和 MS+0.01mg/L NAA+0.8g/L Agar快繁培养基的交替使用，能在有效的控制玻璃化的产生的同时获得大量的无菌苗。
　　2．优化了苎麻4种外植体再生体系。研究表明叶柄和中脉外植体的最佳激素组合为0.2mg/L TDZ+0.04mg/L NAA（100%）；叶片外植体的最佳激素组合为0.2mg/L TDZ+0.06mg/L NAA（98.33%）；茎段外植体的最佳激素组合为了0.2mg/L TDZ+0.02mg/L NAA（95%）。碳源最适浓度为6%蔗糖（茎段外植体的碳源最适浓度为3%蔗糖+1.5%木糖），20℃预处理7d后转入到24℃，8h/16h，光照/黑暗在三角瓶中培养时4种外植体获得最高再生频率。上述因素均能显著影响4种外植体的再生频率。首次采用中脉为外植体，与叶柄类似，两者的再生能力均优于叶片和茎段外植体，表现在取材、操作、再生频率、诱导时间及达到高频再生频率时对激素和其它条件的适应范围等。4种外植体的再生能力与其组织中干细胞或类似细胞的细胞密切相关（中柱鞘附近细胞群、叶脉附近叶肉细胞群和叶片远轴面的角质层细胞群）。叶片外植体具有一种极少而特殊的再生方式，即在叶片远轴面的表皮角质层不经过愈伤诱导阶段而直接诱导再生，后多数发育成为小叶片，少数发育成完整的再生芽。
　　3．建立了一步法苎麻无菌苗生根和炼苗体系。研究了不同类型基本培养基和NAA浓度对苎麻生根炼苗的影响。首次采用霍格兰营养液附加0.025mg/L NAA同时进行生根和炼苗，大幅缩短了生根炼苗时间，提高了苎麻无菌苗生根速度、生根数量和质量，不易染菌，存活率高达100%。
　　4．优化了4种外植体的稳定高效遗传转化体系。使用GFP报告基因、瞬时荧光表达检测和PCR检测对遗传转化过程中的各步骤进行了系统全面的分析，主要包括5个方面：（1）抗生素类型和浓度（Km为30mg/L，Basta为60mg/L，Cef为250mg/L）；（2）外植体及其预处理，包括：外植体类型（叶柄和中脉）、预培养时间（叶片为2d，其它3种外植体为1d）、物理处理（超声波处理、负压处理、热处理（43℃-5min）和冷处理）、生化处理（Sliweet-77）等；（3）根癌农杆菌类型及活性，包括：根癌农杆菌类型、OD600值；（4）共培养阶段的处理（促进T-DNA转移），包括：AS浓度（50mg/L）、Nurse培养液及其浓度（4h-1/2Nurse）、碳源（茎段为3%蔗糖+1.5%木糖；其它3种外植体为6%蔗糖）、激素种类、L-半胱氨酸（100mg/L）、pH值（MES（10mg/L））；（5）抑菌处理方法，包括：抗生素种类和浓度、处理方法。其中外植体的热处理、共培养基中附加 Nurse培养液、L-半胱氨酸和MES对4种外植体遗传转化效率提高显著。叶柄和中脉外植体在遗传转化效率上具有显著的优势，大幅提高了苎麻无菌苗来源外植体的遗传转化效率。

目录

声明

缩略词表

第一章 文献综述

1 苎麻组织培养及遗传转化研究进展

1.1 苎麻组织培养的研究进展

1.2 细胞分裂素（TDZ）在植物再生中的应用

1.3 苎麻遗传转化及转基因研究的进展研究进展

2 植物器官发生研究进展与植物组织培养研究

2.1 植物器官发生研究进展

2.2 植物各类器官维持和诱导与植物再生过程的比较研究

2.3现代分子生物学和显微技术对植物细胞全能性的补充

3 根癌农杆菌介导遗传转化方法的研究进展

3.1 根癌农杆菌介导的植物遗传转化简介

3.2 影响根癌农杆菌介导植物遗传转化效率的主要因素

4 苎麻组织培养及遗传转化研究中存在的问题

4.1 苎麻组织培养研究存在的问题

4.2 苎麻遗传转化研究存在的问题

5 本研究的目的和意义

5.1 苎麻试管苗外植体再生体系的优化

5.2 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系的建立

第二章 苎麻试管苗来源外植体再生体系的优化

前言

1 试管苗的准备

1.1试管苗的获得及外植体的准备体系的优化

1.2 4 种外植体再生体系的建立

1.3 生根和炼苗

1.4 培养基的配制及培养条件

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 AA 和AC处理对苎麻茎尖褐化和存活率的影响

2.2 不同的激素对无菌苗扩繁的影响

2.3 TDZ和NAA（或2, 4-D）对苎麻4种各外植体再生的影响

2.4 4种试管苗来源外植体再生的差异

2.5 使用不同培养器皿对试管苗外植体再生的影响

2.6 温度对无菌苗外植体再生的影响

2.7 早期低温暗培养对无菌苗外植体再生的影响

2.8 碳源对试管苗外植体再生的影响

2.9 凝胶种类对再生的影响

2.10 基本培养基和NAA对无菌苗生根和炼苗的影响

3 讨论

3.1 苎麻试管苗4种外植体再生体系的优化

3.2 影响苎麻再生的因素

3.3 关于苎麻外植体的再生方式

3.4 组织培养技术应用的展望

3.5 应用于遗传转化中时外植体的选择及影响

3.6 本研究有待改进之处

第三章 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系的优化

前言

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 菌株和质粒

1.3 苎麻无菌苗来源外植体的根癌农杆菌介导遗传转化基础体系

1.4 根癌农杆菌介导遗传转化体系的优化

1.5 数据分析

1.6 遗传转化的检测（相关试剂的制备方法见附录）

2结果与分析

2.1 几种抗生素对4种外植体再生的影响

2.2 4种外植体遗传转化后GFP瞬时表达特征

2.3 PCR检测

2.4 外植体类型及其处理对遗传转化效率的影响

2.5根癌农杆菌种类及浓度对4种外植体遗传转化的影响

2.6 共培养培养条件对4种外植体遗传转化的影响

2.7 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系的优化结果

3 讨论

3.1 4种外植体对苎麻遗传转化效率的影响

3.2 三种抗生素对苎麻再生的影响

3.3 影响苎麻遗传转化的主要因素

3.4 报告基因在遗传效率研究中的应用

3.5 本研究的不足之处

参考文献

附录

致谢