菊花高频再生体系建立及根癌农杆菌介导遗传转化体系的优化

摘要

菊花(Dendranthemamorifolium)是多年来经过人工培育和天然种间杂交而来，高度杂合及多倍化和种下变异机制是菊花品种丰富性的来源。菊花的品种多，叶、花型、瓣型变化很大，是色、香、姿、韵俱佳的我国传统名花，与梅、兰、竹共称为“花卉四君子”，菊花不仅受国人的珍惜和推崇，而且也受到世界各国的关注和喜爱。多年来常规育种方法在菊花育种中已经取得巨大成就，但其存在着不能利用其它物种基因资源的局限性。随着菊花遗传转化体系的建立发展、外源基因在细胞中的表达、转化方法的进步等，定向修饰它的某些目标性状并保留原有性状，使其在花色、花期、花型、抗性等方面都得到了极大的改观和发展。由于国内外菊花品种分类标准存在的差异，国外文献报道的一些菊花品种的遗传转化的体系并不适合我国的一些传统菊花品种，因此研究适合我国菊花品种的遗传转化体系有十分重要的意义。 本研究以菊花(Dendranthemamorifolium)‘黄冠’、‘久米荣’、‘山城之光’、‘冬桔’四个品种为试验材料，利用9种分化培养基，研究了不同基因型，不同激素浓度配比，预培养时间，不同外植体类型对菊花愈伤组织诱导、不定芽发生的影响。优化了菊花的再生条件，获得了菊花叶片的高效再生体系。结果表明叶片最适分化培养基分别为：‘黄冠’MS+6BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；‘久米荣’MS+6BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；‘山城之光’MS+6BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；‘冬桔’MS+6BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。比较四个品种的再生能力，发现‘黄冠’，‘久米荣’相当，最高再生率能达到100.0﹪，‘山城之光’为95.9﹪，‘冬桔’最差为90.6﹪。 在建立了四个菊花品种高频再生体系的基础上，利用根癌农杆菌介导的遗传转化法进行遗传转化研究。比较了四个菊花品种分别在被三种的农杆菌侵染后的转化效率差异。将供试的四个菊花品种分别确定了卡那霉素选择压力，头孢霉素浓度，菌液浓度，侵染时间，共培养时间，延迟筛选时间，不同农杆菌菌株的影响，生根筛选浓度等因素，得出四个菊花品种‘黄冠’、‘冬桔’、‘山城之光’、‘久米荣’的卡那霉素选择压力分别为20mg/L，30mg/L，30mg/L，40mg/L；头孢浓度确定为100mg/L；菌液浓度OD600=0.5；侵染时间为20min；共培养时间为2天；延迟筛选时间为4天；生根筛选浓度为1/2MS+15mg/LKM。通过以上因素的确定，得出了品种黄冠在被三种根癌农杆菌菌株侵染后能获得最大再生率，品种山城之光最差。农杆菌菌株LBA4404对四个菊花品种有最强的侵染能力，污染程度最低，农杆菌菌株EHA101最著，且污染程度高。 把经抗性筛选得到的转基因苗通过PCR扩增，得到与阳性对照相同的条带，说明目的基因己成功插入到菊花的基因组中。

目录

文摘

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第1章文献综述

第2章引言

第3章材料与方法

第4章结果与分析

第5章讨论

第6章结论

参考文献

致谢

附录