喹噁啉类药物诱导大肠杆菌产生自由基的机制研究

摘要

喹噁啉-1，4-氮二氧类药物（以下简称喹噁啉类药物）是一类化学合成的抗菌药物，抗菌效果良好，可提高进食效率促进机体生长，在世界范围内有着非常广泛的应用。然而喹噁啉类药物是如何发挥其抗菌作用的，抗菌作用又是通过何种方式进行的仍未清晰，有文献报道喹噁啉类药物在作用细菌后在代谢酶作用下，活化形成药物自由基中间体，药物自由基可能会导致DNA断裂(Suter et al.，1978; Ganley et al.，2001;Chowdhury et al.，2004)。本实验室前期研究表明厌氧条件下，细菌在喹赛多作用之后，产生了大量的ROS(reactive oxygen species，氧自由基)，同时细菌DNA出现损伤断裂(张宏飞，2012)， SOS反应相关基因和蛋白表达升高数倍(李贝，2012)。这说明大肠杆菌在喹赛多作用之后产生了自由基，并出现了严重的DNA损伤的情况，然而DNA损伤以及药物抗菌作用是否与自由基有关系，自由基是如何产生的，这些问题需要进一步研究分析。因此本课题主要通过研究自由基的结构、规律和生成机制，来分析药物抗菌作用与自由基之间的关系。本实验选用对喹赛多敏感的大肠杆菌CVCC2943作为实验菌株，实验所选药物综合考虑药物敏感性、临床使用等多方面，选择了喹赛多、乙酰甲喹喹乙醇进行实验。实验内容分为两部分，一部分是对大肠杆菌CVCC2943在喹噁啉药物作用之后的自由基的性质规律等进行了测定，包括ROS和超氧自由基的产生规律以及药物自由基结构的鉴定;另一部分则是对自由基的产生机制进行了阐述，分为药物自由基的产生机制和呼吸链产生自由基两种途径，并对筛选出来的关键代谢酶进行了验证。
　　1.喹噁啉类药物作用细菌后的自由基的检测
　　首先本研究对喹噁啉类药物在有氧条件和厌氧条件下对大肠杆菌CVCC2943的MIC(最小抑菌浓度)以及MBC(最小杀菌浓度)进行了测定，以此作为后续实验的剂量参考。对细菌在乙酰甲喹、喹乙醇作用后产生的自由基进行了检测，在有氧条件下测定细菌体内的超氧自由基，厌氧条件下测定细菌的ROS，并对喹赛多和乙酰甲喹在不同的作用方式下产生的药物自由基结构进行了测定。
　　对喹噁啉类药物的MIC和MBC测定显示，喹噁啉类药物都具有非常明显的厌氧选择活性，在厌氧条件下，大部分喹噁啉类药物有比较良好的杀菌能力，但在有氧条件下，其抗菌活性明显降低。在本实验中，喹烯酮对大肠杆菌CVCC2943的敏感性较差，MIC大于64μg/ml，故弃去不做后续测试。
　　在张宏飞(2012)的研究中发现，喹赛多在厌氧条件下产生的ROS在1h左右达到最高点后缓慢下降。而本课题的测试中发现，喹乙醇和乙酰甲喹均在30 min左右达到峰值然后随时间缓慢下降，这说明喹噁啉类药物有着相似的自由基产生规律。
　　另外本课题对厌氧条件下喹噁啉类药物诱导产生的自由基通过电子自旋共振波谱仪进行了测定，在细菌与药物孵育的情况，没有检测到单独的电子自旋信号，而通过细菌蛋白液、黄嘌呤氧化酶、低亚硫酸钠的还原活化下，检测到了三重峰的自由基信号。峰之间的间隙约为10G，通过模拟并与文献对比分析，该自由基可能是药物自由基和质子化的药物自由基的混合物。
　　2.自由基产生途径的研究
　　喹噁啉类药物作用细菌后引起了自由基的生成，其自由基的产生方式可能为两种:一是药物通过代谢酶的活化形成药物自由基，对DNA以及其他物质造成损伤，二是在药物自由基对细菌造成损伤后，引起菌体发生应激反应，呼吸链紊乱，生成ROS等自由基。首先是对药物自由基形成的机制进行研究，药物自由基可以在厌氧条件下通过代谢酶还原活化形成，本实验利用不同的代谢酶抑制剂对代谢酶进行阻断，通过细菌计数、自由基以及代谢物的检测来确定相关代谢酶是否影响了药物的抗菌活性。本课题选择了黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOR)、醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)、醛脱氢酶(aldehyde oxidase，AOX)、硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)、尿酸脱氢酶(uricase)、硫氧还原蛋白(thioredoxin reductase)等多种代谢酶作为候选对象。最终确定XOR、含铁的酶类对喹噁啉类的活化有影响，通过叠氮化钠的抑制发现细胞色素类型的氧化酶以及过氧物酶参与了喹噁啉的代谢。代谢酶筛选之后，本课题对XOR进行了一系列的测定，包括:有氧条件下超氧自由基的测定、药物自由基的检测、代谢物的检测、对DNA损伤的检测等，发现XOR可以代谢药物产生自由基，并导致DNA断裂。
　　呼吸链自由基的测定，我们选择电子链阻断剂对呼吸链进行阻断，从而减少呼吸链的“漏电子”情况，防止电子受体氧化不完全形成自由基。在本实验中选择了二巯基丙醇以及鱼藤酮两种阻断剂对呼吸链进行阻断，继而分析在药物作用后细菌内的ROS是不是产生了变化，从而确定呼吸链的自由基和药物作用后的ROS之间的关系。本研究中发现在药物作用后，细菌产生的ROS中有一部分可能是源自呼吸链自由基。
　　综上所述，喹噁啉类药物在作用细菌后引起自由基的产生;在有氧条件下，喹噁啉作用后细菌引起了超氧自由基的生成;在厌氧条件下，在喹噁啉类药物作用之后引起了细菌体内的ROS产生，并检测到了药物自由基;确定了XOR对药物的活化有着关键影响，其中XOR可以在有氧条件下生成超氧自由基，厌氧条件下生成药物自由基，并能造成DNA的损伤;细菌体内的呼吸链的紊乱也产生了部分自由基。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究目的

1．2 研究背景

1．3 研究思路

1．4 研究内容与目标

1．5 研究意义

2．材料和方法

2．1 菌株

2．2 药品和试剂

2．3 主要仪器和设备

2．4 溶液配制

2．5 细菌复苏传代和培养

2．6 喹噁啉类药物的MIC及MBC测定

2．7 喹噁啉类药物作用细菌后的自由基的测定

2．7．1 细菌内ROS的检测

2．7．2 细菌内超氧自由基的检测

2．7．3 药物作用后羟基自由基的检测

2．8 代谢酶抑制剂对喹嗯啉类药物活性的影响

2．8．1 抑制剂有效作用浓度以及作用时间

2．8．2 抑制剂对药物杀菌能力的影响的测定

2．8．3 抑制剂对药物作用后细菌自由基的影响

2．8．4 抑制剂对药物代谢的影响

2．9 XOR相关性质的测定

2．9．1 XOR代谢药物测定

2．9．2 XOR代谢药物产生超氧自由基的测定

2．9．3 DNA损伤的影响

2．10 药物作用后细菌代谢紊乱自由基检测

2．10．1 阻断剂有效作用浓度的检测

2．10．2 药物对细菌呼吸链自由基的影响

2．11 药物自由基结构的鉴定

2．12 统计学分析

3 结果与分析

3．1 喹噁啉药物对E．coil CVCC2943的MIC及MBC的测定

3．2 喹噁啉类药物作用细菌后的自由基的研究

3．2．1 不同药物作用后细菌内ROS水平

3．2．2 不同药物作用后细菌内超氧自由基

3．2．3 药物作用后的羟基自由基的检测

3．3 代谢酶抑制剂对喹噁啉类药物活性的影响

3．3．1 抑制剂作用浓度以及时间

3．3．2 细菌计数法测定抑制剂对药物的影响

3．3．3 抑制剂对药物作用后细菌自由基的影响

3．3．4 酶抑制剂对药物代谢的影响

3．4 黄嘌呤氧化酶对喹噁啉药物活化作用的测定

3．4．1 XOR代谢药物测定

3．4．2 XOR代谢药物产生超氧自由基的测定

3．4．3 DNA损伤的影响

3．5 药物作用后细菌代谢紊乱自由基检测

3．5．1 电子链阻断剂的浓度的确定

3．5．2 药物作用后细菌代谢紊乱自由基检测

3．6 药物自由基中间体结构的鉴定

4 讨论

4．1 喹噁啉类药物作用细菌后引起的自由基类型分析

4．2 自由基的生成机制

4．3 自由基的损伤机制

5 结论

6 全文创新性总结及今后的研究方向

文献综述 药物与自由基

参考文献

致谢

研究生简介

附录