喹噁啉类对大肠杆菌DNA损伤的机制研究

摘要

喹噁啉类化合物(Quinoxalines)为人工合成的一类抗菌药，均属喹噁啉-1，4-二氧化物的衍生物，主要代表药物有卡巴氧(Carbadox，CBX)、喹乙醇(Olaquindox，OLA)、乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)、喹烯酮(Quinocetone，QCT)和喹赛多(Cyadox，CYA)。其中前四种为20世纪合成的化合物，喹赛多为后来研发的喹噁啉类新品种，具有抗菌促生长作用显著、毒副作用低、使用范围广的优点而受到广泛关注。本实验室通过对喹赛多的体外抑菌试验和抗菌机理的研究，表明喹赛多具有较强的抑菌作用和与喹噁啉类的其他药物一样具有相似的损伤细菌DNA的作用。但是关于喹噁啉类化合物损伤DNA的明确的抗菌作用机制至今未得到很好的揭示。本课题选取喹噁啉类中的喹赛多和喹乙醇为代表，及对其敏感的大肠杆菌为研究对象，从喹赛多和喹乙醇对DNA的直接作用和对DNA合成和修复有关的酶两方面进行药物作用机理的研究。菌体内外观察药物对DNA直接作用的损伤情况，并选取与DNA合成和修复过程有关的一些关键酶:E.coli DNA拓扑异构酶Ⅰ、E.coli DNA旋转酶、E.coli DNA聚合酶和E.coli DNA连接酶为研究对象，体外借助凝胶电泳检测和荧光检测技术考察喹噁啉类对细菌DNA损伤的机制进行研究。
　　1.喹噁啉类药物MIC和MBC的测定
　　本实验选用鸡源大肠杆菌CVCC2943，分别在厌氧和有氧条件下检测该菌株对喹赛多、喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹的敏感性。实验采用微量肉汤稀释法检测药物对大肠杆菌CVCC2943的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)。结果测得喹赛多在厌氧条件下的MIC值为1μg/mL，MBC值为4μg/mL，有氧条件下MIC值为16μg/mL，MBC值为128μg/mL;喹乙醇在厌氧条件下MIC值为4μg/mL，MBC值为16μg/mL，有氧条件下MIC值为16μg/mL，MBC值为128μg/mL;卡巴氧在厌氧条件下MIC值为0.25μg/mL，MBC值为1μg/mL，有氧条件下MIC值为2μg/mL;乙酰甲喹在厌氧条件下MIC值为0.5μg/mL，MBC值为2μg/mL，有氧条件下MIC值为2μg/mL，MBC值为16μg/mL。从结果中可看出喹赛多和喹噁啉类的其他药物一样具有很好的厌氧选择活性。由于喹赛多低毒、低残留的特点，并且为新研发的喹噁啉类药物，喹乙醇为已有的喹噁啉类药物，其抗菌作用的具体机理的研究也没有相关报道，结合本实验室对喹乙醇的已有研究，所以本课题选择喹赛多和喹乙醇为代表来研究喹噁啉类致细菌DNA损伤的机制。
　　2.喹赛多和喹乙醇对DNA损伤的直接作用研究
　　以往对喹噁啉类抗菌作用机制的研究多采用同位素标记和电子显微镜观察核酸的变化，本实验采用凝胶电泳检测DNA的损伤，分为药物体外对pBR322质粒DNA的作用和将药物与细菌一起孵育后提取质粒DNA，观察药物对DNA的损伤情况。体外分为有氧和厌氧两种条件，厌氧条件下又分为将药物直接与DNA作用和药物在黄嘌呤氧化酶的代谢下与DNA作用。结果表明无论在有氧还是厌氧下，药物不经黄嘌呤氧化酶代谢均不能使DNA发生断裂。厌氧下喹赛多和喹乙醇经黄嘌呤氧化酶还原可使DNA发生明显的断裂，使DNA发生明显断裂的终浓度均为8μg/mL，当共同孵育30min时，DNA有轻微的断裂，孵育1小时后，DNA就有明显的损伤。体外检测说明喹赛多和喹乙醇经代谢后可直接损伤DNA。体内首先将质粒pBR322转入到细菌中，再与药物一起孵育后提取质粒DNA，结果揭示当喹赛多浓度为4μg/mL时，对细菌体内的质粒DNA有轻微的降解，随着药物浓度的增加，降解的程度增强，当喹赛多浓度为16μg/mL时，菌体质粒DNA发生明显的降解。而喹乙醇作用组当浓度为32μg/mL时，对细菌体内的质粒DNA有轻微的降解，并且随着喹乙醇浓度的增加，质粒DNA损伤的程度并无太大的变化。
　　3.喹赛多和喹乙醇对DNA合成和修复酶的影响
　　实验分别采用凝胶电泳检测和荧光信号强度的变化来检测喹赛多和喹乙醇两种药物对E.coli DNA拓扑异构酶Ⅰ、旋转酶、聚合酶和连接酶活性的影响。前两种酶通过它们各自对超螺旋DNA的解旋作用来作为酶活性的检测指标，后两种酶通过对荧光强度的变化计算各自的反应初速度这一动力学参数来作为它们的活性指标。对拓扑异构酶和旋转酶的检测以超螺旋pBR322 DNA为研究对象，结果显示无论是药物直接与两种酶反应还是药物在代谢酶的作用下与两种酶反应，两种酶均不能对各自的底物DNA进行解旋，说明喹赛多和喹乙醇对E.coli DNA拓扑异构酶Ⅰ和旋转酶的活性没有抑制作用，药物并不是通过抑制两种酶的活性来阻碍DNA的合成。对E.coli DNA聚合酶和连接酶活性的检测是通过反应初速度的变化来判断，结果表明喹赛多和喹乙醇无论是直接与DNA聚合酶反应还是在代谢后与该酶反应，聚合酶催化的DNA聚合反应的初速度有明显的下降，说明药物对聚合酶的活性有明显的抑制作用，并且随药物浓度的增加抑制作用增强，药物作用30min便可产生抑制。脱一氧喹赛多和脱二氧喹赛多对聚合酶活性的影响，结果显示当在N1位脱去氧原子时，聚合酶催化的聚合反应初速度有明显的下降，但当N4位脱去氧原子或N1位和N4位均脱氧时，聚合酶催化的聚合反应初速度无明显变化。说明N1脱一氧喹赛多也可抑制聚合酶的活性。两种药物直接与连接酶反应后可对该酶催化的DNA连接反应的初速度产生一定的下降作用，但当药物代谢后对该酶催化的连接反应的初速度无明显变化，说明药物原型也可对连接酶的活性产生抑制。
　　由此可得出喹赛多和喹乙醇在黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶还原体系下经还原代谢直接损伤DNA。喹赛多和喹乙醇对DNA损伤的另一途径是两种药物原型可直接对DNA聚合酶和连接酶的活性产生抑制，而这两种酶在DNA的合成、修复和重组中是不可缺少的酶，因此最终造成DNA产生损伤。喹赛多和喹乙醇经还原代谢后也可对聚合酶的聚合反应初速度产生影响，结合对喹赛多N1位脱氧后对聚合酶的影响，说明喹赛多代谢后产生的N1位脱氧喹赛多可抑制聚合酶的活性，但是N4位脱氧喹赛多和脱二氧喹赛多不能抑制聚合酶的活性，并且两种药物代谢后对连接酶的活性也不能产生抑制。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究目的

1．2 研究背景

1．3 研究思路

1．4 研究内容

1．5 研究意义

2 材料与方法

2．1 试验菌株

2．2 药品和试剂

2．3 主要仪器和设备

2．4 溶液配制

2．5 细菌复苏传代和培养

2．6 喹噁啉类药物MIC和MBC的测定

2．7 体外DNA损伤的作用研究

2．7．1 pBR322质粒DNA的提取

2．7．2 酶切鉴定

2．7．3 喹赛多和喹乙醇原型对DNA损伤的浓度考察

2．7．4 喹赛多和喹乙醇原型对DNA损伤的时间考察

2．7．5 不同浓度喹赛多和喹乙醇代谢后对DNA损伤的检测

2．7．6 喹赛多和喹乙醇代谢不同时间点对DNA损伤的检测

2．8 菌体内质粒DNA损伤的研究

2．9 药物对DNA作用的紫外光谱吸收

2．9．1 喹赛多和喹乙醇原型对DNA作用的紫外光谱吸收

2．9．2 喹赛多和喹乙醇代谢后对DNA作用的紫外光谱吸收

2．10 大肠杆菌拓扑异构酶I活性的检测

2．10．1 喹赛多和喹乙醇原型对E．coli拓扑异构酶Ⅰ活性影响的检测

2．10．2 喹赛多和喹乙醇代谢下对E．coli拓扑异构酶Ⅰ活性影响的检测

2．11 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌DNA旋转酶活性影响的检测

2．11．1 喹赛多和喹乙醇原型对E．coli Gyrase的活性影响

2．11．2 喹赛多和喹乙醇代谢下对E ．coli Gyrase的活性影响

2．12 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌DNA聚合酶活性影响的检测

2．12．1 E．coli DNA聚合酶活性的定量分析

2．12．2 喹赛多和喹乙醇原型对E．coli DNA聚合酶活性的检测

2．12．3 喹赛多和喹乙醇代谢下对E．coli DNA聚合酶活性影响的检测

2．12．4 脱一氧和脱二氧喹赛多对聚合酶活性检测

2．12．5 喹赛多和喹乙醇对E．coil DNA聚合酶活性的时间考察

2．13 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌DNA连接酶活性影响的检测

2．13．1 分子信标与DNA的杂交

2．13．2 E．coli DNA连接酶活性的检测

2．13．3 喹赛多和喹乙醇原型对E．coli DNA连接酶活性的检测

2．13．4喹赛多和喹乙醇代谢下对E coli DNA连接酶活性的检测

3 结果

3．1 喹嚼啉类对大肠杆菌CVCC2943的MIC和MBC

3．2 喹赛多和喹乙醇对DNA损伤作用的检测

3．2．1 药物原型对DNA损伤的浓度考察

3．2．2 药物原型对DNA损伤的时间考察

3．2．3 药物代谢后对DNA损伤的检测

3．2．4 药物代谢后不同时间点对DNA损伤的检测

3．2．5 药物对细菌质粒DNA损伤的检测

3．3 喹赛多和喹乙醇与DNA作用的紫外光谱吸收

3．3．1 药物原型对DNA作用的紫外光谱吸收

3．3．2 药物代谢后对DNA作用的紫外光谱吸收

3．4 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌拓扑异构酶活性的检测

3．4．1 药物原型对E．coli拓扑异构酶Ⅰ活性的检测

3．4．2 药物代谢后对E．coil拓扑异构酶Ⅰ 活性的检测

3．4．3 药物原型对E．coli旋转酶活性的检测

3．4．4 药物代谢下对E．coli DNA旋转酶活性的检测

3．5　喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌DNA聚合酶活性的影响

3．5．1 E．coli DNA聚合酶活性的定量分析

3．5．2 药物原型对E．coli DNA聚合酶活性的影响

3．5．3 药物代谢下对E．coli DNA聚合酶活性的影响

3．5．4 脱一氧和脱二氧喹赛多对聚合酶的影响

3．5．5 药物作用不同时间后对E．coil DNA聚合酶活性的影响

3．6 喹赛多和喹乙醇对大肠杆菌DNA连接酶活性的影响

3．6．1 分子信标与DNA的杂交

3．6．2 E．coli DNA连接酶活性的检测

3．6．3 药物原型对E．coil DNA连接酶活性的检测

3．6．4 药物代谢下对E．coli DNA连接酶活性的检测

4 讨论

4．1 喹噁啉类对DNA的损伤

4．2 喹噁啉抗菌过程中有关的酶

5 结论

6 全文创新性总结及今后的研究方向

7 文献综述

参考文献

致谢

附录