Mechanism of Somatostatin and its Receptors in Regulation of Apoptosis and Steroidogenesis of Mouse Sertoli cells and Bovine Granulosa Cells by RNAi

摘要

目前生长抑素及其受体在垂体上已得到广泛研究。这主要是由于垂体中的生长激素细胞释放生长激素(GH)。这些操作技术的进步揭示了这些受体新的生物学功能，特别是他们调控生理机能和抑制肿瘤细胞的生长。细胞特异性生长抑素受体信号可以使得我们了解垂体激素控制和细胞增殖的原理。然而，目前这些受体在性腺上的研究很有限。
　　1.生长抑素及其受体对小鼠支持细胞凋亡和生长的功能调控。
　　最近研究表明，支持细胞是生长抑素(SST)多肽调控的靶细胞。因此，本研究用SRIF14处理小鼠支持细胞探究生长抑素受体表达及其与年龄的关系与同源调控。另外，还检测了细胞增殖、凋亡率和相关调控基因的表达。结果发现，支持细胞可以表达SST15型受体。不同日龄小鼠用实时荧光定量PCR在mRNA水平检测受体表达，发现SSTR2和SSTR5在支持细胞发育阶段大量表达。另外，SRIF14处理细胞后与对照组相比并没有显著提高这两个受体的表达量，说明受体表达不受SRIF14影响。生长抑素以剂量依赖方式调节腺苷酸环化酶激活剂诱导的cAMP的产生。低剂量(100pm和10nm)和高剂量(1μm)组明显促进了G1期细胞凋亡，并有剂量依赖关系(p＜0.05)。WesternBlot分析发现，casp3和P21的表达增加，bcl2和Igf1的表达降低，证实了上述结果。生长抑素同样以剂量依赖方式在mRNA水平抑制kit1基因的表达，后者是调控精子生成的重要基因。本研究结果表明，生长抑素及其受体（SSTR2和SSTR5）是调节支持细胞发育的重要标记，可通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期对支持细胞发育表现出生理抑制作用。
　　2.生长抑素受体2和5的构型激活及其与促卵泡素相互作用对未成年小鼠支持细胞凋亡的调控
　　生长抑素受体2和5是未成年小鼠支持细胞凋亡的主要调控因子，降低了SSTR2和SSTR5在蛋白水平上的表达。另外，本研究利用短发夹RNA分别沉默了SSTR2和SSTR5基因并分析了转染效率，结果显示转染后短发夹RNA在mRNA水平对SSTR2和SSTR5分别下调了54％和62％。小鼠SSTR2和SSTR5基因沉默抑制了cAMP水平的升高（最高效载体分别达到145％和89％）和ERK1/2磷酸化。另外，受体基因沉默对cAMP水平升高的影响被百日咳毒素所阻断。生长抑素受体2和5在小鼠支持细胞中构型被激活，在蛋白质水平下调caspase3，上调Bcl2，进而抑制细胞凋亡（SSTR2=SSTR5，p＜0.05）。此外，用FSH处理转染细胞后的细胞凋亡率（平均5.5％，p＜0.05）比对照组(9.6％)明显降低。上述结果表明，SSTR2和SSTR5可能通过构型激活调节支持细胞凋亡，独立于其配体。另外，这两种受体作为内源FSH抑制因子在睾丸发育的重要时期可能对支持细凋亡有重要作用。
　　3.构型和促卵泡素诱导的生长抑素受体2在牛颗粒细胞凋亡和类固醇激素合成中的作用
　　利用原代牛颗粒细胞作为细胞模型研究生长抑素受体2在维持卵巢功能中的潜在作用。结果发现，牛颗粒细胞表达SSTR2受体，用FSH处理颗粒细胞后SSTR2受体在蛋白水平表达显著提高，提示SSTR2很可能受FSH调节。进一步用小干扰RNA片段进行沉默，并在转录和翻译水平分别测定其对SSTR2的干扰效率，证明内源性SSTR2表达被阻断，证明SSTR2的构型激活对颗粒细胞具有调节作用，因为cAMP水平升高2.4倍，孕激素基础分泌量升高2倍(p＜0.05)，StAR和P450ssc在mRNA水平显著上调，但雌激素水平和芳香酶在mRNA水平无明显变化。此外，沉默SSTR2后颗粒细胞凋亡降低52.5％(p＜0.05)，促进了细胞增殖。印记检测后续蛋白，发现Bcl-2表达上调，而caspase3和Bax表达下调。这些结果表明，SSTR2亚型不依赖生长抑素且通过选择性构型调控颗粒细胞凋亡、增殖和激素分泌。假设SSTR2对性腺有局部抑制作用，发现转染ssRNAi-2后，细胞凋亡率显著降低（分别为6.8％和1.9％，p＜0.05），比FSH处理的效果更明显。凋亡蛋白表达和类固醇激素mRNA水平与凋亡率降低和孕激素分泌量增加有关。本研究结果表明，SSTR2可能作为FSH的局部抑制因子对颗粒细胞和类固醇激素合成起重要作用。

目录

论文说明

声明

CONTENTS

摘要

Abstract

Abbreviations

Chapter 1．Introduction

1．1 Somatostatin and its signaling

1．2 Somatostatin and Testis

1．3 Somatostatin and FSH in testis

1．4 Presence of somatostatin receptors on Granulosa cell

1．5 Interaction of FSH with SSTR2 in the ovary

1．6 Constitutive activity of SSTR2 and SSTR5

1．7 Conclusion and hypothesis

Chapter 2-Somatostatin and its receptors：functional regulation in the development of mice Sertoli cells

2．1 Material and Methods

2．1．1 Animals

2．1．2 Chemicals

2．1．3 Cell Isolation and Culture

2．1．4 RNA extraction and Real-time PCR

2．1．5 Immunohistochemistry (IHC) of somatostatin receptors in mice testes

2．1．6 Immunocytochemistry

2．1．7 cAMP measurement

2．1．8 Cell Cycle Analysis

2．1．9 Apoptotic activity

2．1．10 Western Blot analysis

2．1．11 Statistical analysis

2．2．Results

2．2．1．Expression of SSTR receptors

2．2．2．The expression of somatostatin receptors subtypes in different developmental stages of Sertoli cells

2．2．3．Forskolin-induced intracellular cAMP accumulation in SRIF14 treated-mice Sertoli cells

2．2．4．Homologous regulation of SRIF receptors

2．2．5．SRIF14 blocked cellular growth in mice Sertoli cells

2．2．6．SRIF increased apoptotic cells in mice Sertoli cell culture

2．2．7．Cell cycle and apoptotic protein expressions

2．2．8．SRIF14 down regulated the igfl and kitl mRNA expression in mice Sertoli cells

2．3．Discussion

Chapter 3．Constitutive activation of Somatostatin receptor 2 and 5 and their interaction with follicle-stimulating hormone in regulating immature mouse Sertoli cells apoptosis

3．1 Material and Methods

3．1．1．Isolation of mice Sertoli cells (SCs)

3．1．2 Construction of recombinant vectors and transfection

3．1．3 Quantitative Polymerase chain reaction

3．1．4 cAMP measurements

3．1．5 Assessment of cell Apoptosis

3．1．6 Western blot

3．1．7 Statistical analysis

3．2 Results

3．2．1 Selective knock down of SSTR2 and SSTR5 in mouse SCs

3．2．2 Selective knockdown of SSTR2 and SSTR5 regulates ERK1／ERK2 signaling

3．2．3 SSTR2 and SSTR5 are important for their constitutive and FSH-induced regulation on SCs apoptosis

3．2．4 Effect of selective knockdown of SSTR2 and SSTR5 on basal and FSH-induced apoptotic regulatory proteins

3．3 Discussion

Chapter 4．Constitutive and follicle-stimulating hormone-induced action of somatostatin receptor-2 on regulation of apopotosis and steroidogenesis in bovine granulosa cells

4．1 Material and Methods

4．1．1 Isolation and culture of bovine GCs

4．1．2 Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for SSTR2 expression

4．1．3 Construction and transfection of recombinant ssRNA-1 and ssRNAi-2 vectors for SSTR2 and experimental design

4．1．4 Real time PCR for SSTR2 and associative genes

4．1．5 Measurement of estradiol and progesterone levels

4．1．6 Intracellular cAMP measurement

4．1．7 Cell apoptosis and proliferation detection

4．1．8 Western blot assay

4．1．9 Statistical analysis

4．2 Results

4．2．1 Expression of SSTR2 in bovine GCs

4．2．2 Transfection efficiency of recombinant vectors and expression in bovine GCs

4．2．3 Follicle-stimulating hormone (FSH) regulated the SSTR2 protein expression in bovine GCs

4．2．4 Treatment with FSH augmented progesterone production decreased apoptosis and increased cell proliferation in ssRNAi-2 transfected cells

4．2．5 SSTR2 silencing increased basal and FSH-induced progesterone production

4．3 Discussion

5 Conclusion and Future Prospects

References

7．List of Figures

8 List of Tables

Acknowledgement

10 Scientific Contributions