百脉根小GTPase激活蛋白GAPs在根瘤发育中的功能研究

摘要

豆科植物分泌类黄酮诱导根瘤菌合成结瘤因子是共生结瘤过程的第一步，百脉根中结瘤因子受体NFR5与NFR1形成异源二聚体，并且被NFR1磷酸化，NFR5和NFR1直接与结瘤因子结合，把信号传递给下游蛋白。ROP类小G蛋白ROP6与NFR5相互作用，并在根瘤原基和早期根瘤中特异性表达。本实验室前期研究鉴定了三个ROP类小G蛋白的激活蛋白RacGAPs，分别为LjRacGAP1，LjRacGAP2，LjRacGAP3，并验证了它们与ROP6-CA的相互作用。基于此基础，本研究对这三个RacGAPs进行了蛋白互作、表达分析、亚细胞定位等研究，结果如下:
　　1.利用酵母双杂交实验，证明这三个RacGAPs蛋白都能与ROP6组成型活化突变体相互作用。
　　2.Real-TimePCR的结果显示，只有RacGAP2基因在瘤里上调表达。构建RacGAPsPro∷GUS重组质粒，组织化学染色显示RacGAP2在根瘤原基、早期根瘤和中期根瘤中有特异性表达，成熟根瘤仅在维管束中表达，而RacGAP1和RacGAP3在根瘤中没有明显表达。
　　3.分离鉴定了RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突变体，得到的纯合植株并没有表现出与根瘤共生相关的表型，认为这两个基因不参与结瘤共生。
　　4.烟草叶片细胞中的BiFC进一步验证RacGAP2与ROP6及其组成型活化形式相互作用，并且互作发生在可能为囊泡的点状结构上。
　　5.RacGAP2在烟草叶片细胞中的定位于点状结构上，与BiFC实验观察到的点状结构相似。然而当其与NFR5共表达时，RacGAP2除了原有的小点外，还出现了与NFR5重合的大囊泡;当与ROP6共表达时，RacGAP2原有的小点消失，出现与ROP6重合的略大的点。此结果进一步表明RacGAP2与NFR5、ROP6的互作与囊泡运输有关。
　　6.在根中超表达RacGAP2，超表达植株和对照组植株结瘤数统计结果显示没有显著差异，根毛形状、根瘤形态等也没有明显变化。RacGAP2的RNAi植株结瘤数增多，表明RacGAP2基因在共生信号转导途径中发挥负调控作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 生物固氮的种类

1．2 豆科植物与根瘤菌根瘤共生固氮系统

1．2．1 根瘤的形成过程

1．2．2 结瘤因子受体蛋白激酶

1．3 小G蛋白家族

1．3．1 小G蛋白调控机制

1．3．2 小G蛋白的分类

1．3．3 ROP——植物中唯一的小G蛋白类胞外信号分子

1．3．4 ROP调控的功能

1．4 RopGAP的调控机制

1．4．1 CRIB-type RopGAPs

1．4．2 PH-Type RopGAP

1．5 研究目的及意义

2 实验材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和质粒

2．2 方法

2．2．1 酵母双杂交

2．2．2 蛋白在烟草叶片中瞬时表达

2．2．3 表达分析

2．2．4 百脉根毛根转化

2．2．5 CTAB法提取植物基因组DNA

2．2．6 GATEWAY方法构建载体

3 结果与分析

3．1 ROP6与RacGAPs蛋白的相互作用

3．2 RacGAPs基因的表达分析

3．2．1 组织化学染色检测RacGAPs基因的表达

3．2．2 Real-time PCR检测RacGAPs基因的表达

3．3 RacGAPs LORE1插入突变体研究

3．3．1 RacGAP1突变体研究

3．3．2 RacGAP2突变体研究

3．3．3 RacGAP3突变体研究

3．4 RacGAP2的研究

3．4．1 RacGAP2蛋白结构分析

3．4．2 RacGAP2与ROP6在烟草细胞内相互作用

3．4．3 RacGAP2蛋白的亚细胞定位

3．4．4 RacGAP2超表达

3．4．5 RacGAP2 RNA干涉

4 总结与讨论

4．1 总结

4．2 讨论

4．3 展望

参考文献

附录一：本研究所用引物

附录二：LjRacGAPs cDNA和氨基酸序列

致谢