鸭甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的表达及初步应用

摘要

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由小RNA病毒DHV(Duck Hepatitis Virus)引起的一种以雏鸭肝炎和出血为主要病变的传染性极强的疾病。VP0、VP1作为DHV的主要结构蛋白，有很好的免疫原性。通过对VP0、VP1基因截短，筛选出亲水性强的优势抗原区并进行表达，制备了VP0、VP1截短基因的多克隆抗体(PcAb)，建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原抗体的快速检测方法。
　　1.VP0、VP1截短基因的表达
　　以VP0、VP1基因为模板，经PCR扩增得到VP0F1、VP0F2、VP0F3、VP1F1、VP1F2共5段序列，将VP0F1-3、VP1F1-2各自拼接得到VP0、VP1截短基因。将VP0、VP1截短基因克隆到表达载体pET28a，构建pET28a-VP0/VP1（截短）重组质粒，在16℃过夜条件下经IPTG诱导获得VP0、VP1截短蛋白并进行纯化。结果经SDS-PAGE及westernblot分析，证明VP0、VP1截短蛋白纯化效果良好，免疫原性强。
　　2.鸭甲型病毒性肝炎抗体间接ELISA检测方法的建立
　　以纯化的VP0截短蛋白为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸭IgY为酶标二抗，建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗体的间接ELISA方法。通过优化各种条件，最终确定VP0截短蛋白最佳包被浓度为2μg/mL，鸭血清最佳稀释度为1∶320，HRP标记的兔抗鸭IgY最佳稀释度为1∶4000，该方法特异性强、敏感性高、重复性好。
　　3.VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备
　　以纯化的鸭甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的重组蛋白为免疫原，四次免疫体重约2.5kg的白兔。效价较高时颈动脉采血，收集并纯化血清，制备抗VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体。以纯化的DHAV为包被抗原，用间接ELISA检测VP0、VP1截短蛋白多抗的效价，结果显示抗VP0截短蛋白多抗的效价为51200，抗VP1截短蛋白多抗的效价为12800。
　　4.鸭甲型病毒性肝炎抗原夹心ELISA检测方法的建立
　　以纯化的VP0截短蛋白多抗为包被抗体，以鸭多抗为检测抗体，建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原的夹心ELISA方法。通过对各级条件的优化，确定VP0截短蛋白多抗最佳包被稀释度为1∶16000，鸭多抗最佳稀释度为1∶200，HRP标记的兔抗鸭IgY最佳稀释度为1∶3000。由试验结果可知该方法重复性好、特异性强。
　　综上可知，本研究通过筛选VP0、VP1基因的亲水强的优势抗原区，成功表达了抗原性强的VP0、VP1截短蛋白，制备了抗VP0、VP1截短蛋白的兔多抗，并建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原抗体的特异性强、重复性好的快速ELISA检测方法，这对该病的诊治和预防有重要意义。

目录

声明

摘要

缩略语表

文献综述

1 DVH概述

1．1 DHAV的流行及分布

1．2 DHAV的分类地位

1．3 DHAV病原学特性

1．4 DHAV分子生物学特性

1．5 DHAV诊断方法的研究

1．6 截短基因的表达

2 研究目的与意义

材料方法

1 试验材料

1．1 毒株、动物、质粒和血清

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要培养基和溶液的配置

2 方法

2．1 鸭甲型肝炎病毒的增殖与纯化

2．2 VP0、VP1蛋白的分段设计与引物合成

2．3 VP0、VP1截短基因的克隆

2．4 重组表达质粒的构建

2．5 重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化

2．6 间接ELISA检测方法的建立

2．7 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备

2．8 夹心ELISA检测方法的建立

试验结果

1 鸭甲型肝炎病毒(DHAV-I)的浓度测定

2 VP0、VP1截短基因的克隆表达

2．1 VP0、VP1基因RT-PCR的扩增结果

2．2 VP0F1-3、VP1F1-2基因和VP0、VP1截短基因扩增结果

2．3 pET28a-VP0／VP1(截短)重组表达质粒的鉴定

2．4 截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索及表达形式的鉴定

2．5 可溶性截短蛋白的纯化及浓度的测定

2．6 截短蛋白的Western blot结果

3 鸭肝炎病毒VP0截短蛋白间接ELISA检测方法的建立

3．1 VP0截短蛋白最佳包被浓度和鸭血清稀释度的确定

3．2 最佳包被条件的确定

3．3 最佳封闭剂和封闭时间的确定

3．4 血清最佳作用时间的确定

3．5 酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定

3．6 最佳显色时间的确定

3．7 阴阳性临界值的确定

3．8 特异性试验

3．9 敏感性试验

3．10 重复性试验

3．11 包被抗原保存期试验

4 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备

4．1 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体效价的测定

4．2 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体浓度的测定

5 夹心EUSA检测方法的建立

5．1 捕获抗体的确定

5．2 最佳封闭剂和封闭时间的确定

5．3 捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定

5．4 酶标二抗最佳稀释度的确定

5．5 最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定

5．6 最佳显色时间的确定

5．7 阴阳性临界值的确定

5．8 特异性试验

5．9 重复性试验

讨论

1 VP0、VP1的截短表达

2 VP0、VP1截短蛋白的分析

3 间接ELISA检测方法

4 夹心ELISA检测方法

结论

参考文献

致谢