华中地区三种畜禽病原菌耐药和毒力的流行性及分子特征研究

摘要

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌都是重要的人畜共患病致病菌和食源性病原菌。它们不仅导致畜禽患病，而且能通过食物链或接触患病动物而传递到人。抗生素是治疗患病动物的首选，但同时也产生了耐药菌。而这些耐药菌也能通过动物或食物链传递给人。本研究对华中地区三省(河南省、湖北省和湖南省）大型养殖场（猪、鸡和奶牛）的三种主要致病菌的耐药性、耐药基因、毒力基因和基因型的流行性进行调查研究，不仅提供了相关的监测信息，也提供临床使用抗生素提供用药方案以保护动物健康和食品安全，为进一步的科学研究奠定基础。
　　1.样品采集
　　2010年3月-2011年7月从河南省、湖北省和湖南省的大型养殖鸡场、猪场和奶牛场采集健康动物泄殖腔或肛门拭子样品2185份，鸡场来源837份，猪场来源930份，奶牛场来源418份。每份样品同时进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌的培养和分离鉴定。
　　2.华中地区畜禽沙门氏菌耐药和毒力的流行性及分子特征研究
　　通过生化反应和invA基因的PCR鉴定，共鉴定出248株(11.35％，248/2185)沙门氏菌。鸡源、猪源和奶牛源沙门氏菌的分离率分别为12.54％(105/837)、4.09％(38/930)和25.12％(105/418)。从华中农业大学兽医院得到了209株猪源沙门氏菌。共有457株沙门氏菌参与了血清型鉴定试验，抗生素敏感性试验等。
　　通过O抗原和H抗原的玻片凝集法，395株菌共鉴定出8个血清群和41个血清型，62株沙门氏菌无法判定血清群。 B群(n=205，44.86％)和C1群(n=141，30.85％)是优势血清群;Typhimurium12.47％(n=57)和Ⅲb4.81％(n=22)为优势血清型。鸡源沙门氏菌中优势血清型为Typhimurium(n=20，4.38％)和Enteritidis(n=9，1.97％);猪源沙门氏菌中优势血清型为Ⅲb(n=22，4.81％)和Typhimurium(n=11，2.41％);奶牛源沙门氏菌中优势血清型为Typhimurium(n=26，5.69％)和Agona(n=12，2.63％)。
　　用琼脂稀释法检测了沙门氏菌对24种抗生素的敏感性，结果显示，188株菌(41.14％)对测试的抗生素全部敏感;220株菌(48.14％)在MIC表型上至少对一种抗生素耐药;所有试验菌株对亚胺培南的敏感性表现出敏感或中介。萘啶酸、复方新诺明、多西环素和四环素的耐药性最高，分别为39.17％、39.61％、28.22％和27.58％。试验菌株对所有兽医专用抗生素均表现出耐药性:恩诺沙星(24.51％);氟苯尼考(20.13％);头孢噻呋(7.44％);头孢喹肟(5.25％);对人畜共用抗生素也表现出耐药性:环丙沙星(24.07％);庆大霉素(19.69％);头孢曲松(6.34％);阿莫西林/克拉维酸(4.38％)。阿奇霉素是大环内酯类的抗生素，其耐药率为16.19％。在兽医临床上使用不多的抗生素也表现出了耐药性，如多粘菌素B和磷霉素，耐药率分别为18.82％和12.04％。在测试的24种抗生素中，鸡源和猪源沙门氏菌对23种抗生素表现出耐药性，耐药率范围分别为1.90％～49.52％和0.40％～48.18％;而奶牛源沙门氏菌仅对12种抗生素表现出耐药性，耐药率范围为0.95％～10.48％。159株(34.72％)沙门氏菌表现为耐3类以上抗生素多重耐药菌，包括70株来自不同省份和不同健康动物源的分离菌和89株来自华中农业兽医院患病猪源。
　　用MIC检测和验证超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的结果表明有25株(5.47％，n=457)沙门氏菌为产ESBLs的细菌，3株来自华中农业大学兽医院的猪源沙门氏菌为疑似产ESBLs的菌株。25株产ESBLs的沙门氏菌的来源于湖北的健康鸡源沙门氏菌（2株）、河南的健康鸡源沙门氏菌（15株）和华中农业兽医院的患病猪源沙门氏菌（8株）。
　　在沙门氏菌敏感菌株(n=188)中有80株菌株鉴定出了17个血清型，Typhimurium(n=28)是优势血清型。在多重耐药的沙门氏菌菌株中鉴定出26个具体的血清型，Enteritidis(n=10)和Ⅲb(n=10)为优势血清型，区别在于Enteritidis主要来自鸡源，而Ⅲb主要来自患病猪源。在所有的血清型中，萘啶酸的耐药性为100％。在多重耐药沙门氏菌中，不同血清型菌株的耐药表型略有差异。血清型为Enteritidis的10株菌株的耐药表型是萘啶酸-复方新诺明-喹乙醇-乙酰甲喹;而血清型为Ⅲb的10株菌株的耐药表型是氨苄西林-阿莫西林-萘啶酸-复方新诺明。
　　用PCR的方法对187株在MIC表型中耐2类（含2类）不同抗生素的沙门氏菌检测了140个耐药基因。结果表明有58个(41.43％)耐药基因经检测为阴性，82个(58.57％)耐药基因经检测为阳性。阳性率在90％以上的耐药基因有27个，分别为:2murA(n=173,92.51％),ISVsa3(n=177,94.65％),aadA2(n=179,95.72％), aadA1(n=180，96.26％)，merR和tolC均为181株(96.79％)， parE和class1均为182株(97.33％)，emrB和mdlB均为184株(98.40％)，qacE△1(n=185，98.93％)，gyrA、gyrB、acrA和mdfA均为186株(99.47％)。以下的耐药基因阳性率为100％: parC、tetB、ompC、ompF、ramA、acrB、acrE、acrF、emrA、ydhE、mdtB和mdtC。
　　不同动物来源的沙门氏菌在耐药基因的分布上不仅有相同点，也存在差异。相同点是81个阳性耐药基因中的63个阳性耐药基因在鸡源、猪源和奶牛源沙门氏菌中均能检测到，如ESBLs类、外排泵类和整合子类等。不同点则体现在:(1) ereB仅存在于奶牛源菌;marR、mcp/Tn1721、rmtB仅存在于鸡源菌;dfrIa、DHA、tetC、Tn1、Tn2、Tn4、merA、rmtA仅存在于猪源菌;(2) dfrVI、CMY-2、tnp/Tn10、tnpR/Tn1721、ermB和fosA3存在于鸡源菌和猪源菌。
　　140株不同来源的沙门氏菌为产ESBLs和AmpC菌株。92株菌含单个亚型耐药基因:OXA-1(n=59),TEM-1(n=23),DHA(n=5),CTX-M-3(n=4),CMY-2(n=1)。鸡源和奶牛源沙门氏菌携带了TEM-1、CTX-M-3和OXA-1;猪源沙门氏菌携带了TEM-1、CMY-2、DHA和OXA-1。河南省和湖南省分离的不同动物源沙门氏菌均不含CMY-2、DHA;湖北省分离的沙门氏菌中不含DHA;华中农业大学兽医院沙门氏菌不含CTX-M-3。43株沙门氏菌同时携带了两种不同的耐药基因亚型，以7种不同的组合方式呈现，分别是TME-1+CMY-2、TEM-1+DAH、TME-1+OXA-1、CTX-M-3+ DHA、CTX-M-3+OXA-1、OXA-1+CMY-2和OXA-1+DHA，而且这种耐药基因组合的方式只存在与鸡源和猪源沙门氏菌中。其余5株沙门氏菌表现出三种不同耐药基因亚型同时存在的组合方式:TEM-1+OXA-1+CMY-2仅存在于鸡源沙门氏菌;TEM-1+OXA-1+DHA和CTX-M-3+OXA-1+DHA都只存在于猪源沙门氏菌中。
　　产ESBLs和AmpC的140株菌株中，共有有23种明确血清型。Ⅲb(group C1)、Enteritidis，Typhimurium为优势血清型。140株菌均为至少耐2类（含耐2类）不同抗生素的多重耐药菌，以8重耐药菌、11重耐药菌和10重耐药菌最多，分别为24株、23株和20株。在81个阳性耐药基因中，这140株菌含有除ereB，ESBLs和AmpC之外的75个耐药基因(92.59％，75/81)。携带aac(6')-Ib-cr的有81.43％株(114/140)，携带oqxA、oqxB分别为44.29％(62/140)、42.14％(59/140)，同时携带这三种基因的有41.43(58/140)。携带class1和class1-int-vair的分别为97.86％(137/140)，9.29％(13/140)。同时携带这五种耐药基因(aac(6')-Ib-cr+oqxA+oqxB+ class1+class1-int-vair)的有7.86％(11/140)。携带转座子和插入元件的范围是0.71％～95.00％。
　　187株沙门氏菌用PCR方法检测了26个毒力因子，结果表明:阳性毒力因子有23个(88.46％，23/26);仅有gipA、flgK和siiD为阴性。在阳性毒力因子中，stn、hilA、prgH、sopB、bcfC、fimA、rpoS的阳性率为100％;其余阳性毒力因子的阳性率在11.76％～99.47％。与T3SS-1、T3SS-2有关的avrA、ssaQ的阳性率分别为70.59％、83.42％。
　　经MLST分析，沙门氏菌共有5种STs，ST1(36.90％)、ST6(28.88％)和ST4(13.90％)为优势的ST型。华中农业大学兽医院患病猪源菌株中ST6(n=51)和ST1(n=39)为优势型;其他三省不同健康动物来源菌株中ST1(n=30)和ST4(n=23)为优势型。鸡源菌株中优势型为ST4(n=20)和ST1(n=12);猪源菌株中优势型为ST1(n=13);奶牛源菌株中优势型为ST1(n=5)。产ESBLs和AmpC的沙门氏菌中ST1(n=55，39.29％)为优势型。
　　将187株沙门氏菌的血清型和MLST进行分析，结果表明共有66株菌(35.29％，66/187)同时拥有确定的血清型和ST。在B群中有21株菌，表现为10种不同的血清型，和3种STs(ST1、ST6和ST57)，其中ST1(n=18)最多，涵盖了全部的血清型。在C1群中有25株菌，表现为9种不同的血清型和2种STs(ST1和ST6); ST1(n=8)涵盖了5种血清型， ST6(n=20)涵盖了7种血清型。全部9株D1群菌仅为ST4，但同时表现出不同的血清型(Enteritidis和Ⅱ);3株为E1群的三个血清型菌株均为ST65;8株为E4群有4个血清型和3种STs(ST1、ST4和ST65)。
　　3.华中地区畜禽金黄色葡萄球菌耐药和毒力的流行性及分子特征研究
　　从2185份采集的健康动物样品中共分离到85株金黄色葡萄球菌，分离率为3.89％(85/2185);其中鸡源菌、猪源菌和奶牛源菌的分离率依次为3.11％(26/837)、3.44％(32/930)和6.46％(27/418)。24株(28.24％，24/85)金黄色葡萄球菌分离菌株为凝固酶阴性，其中鸡源菌株最多(54.17％，13/24)。用PCR的方法鉴定了金黄色葡萄球菌的血清型，56株菌(65.88％，56/85)为cap5型，15株菌(17.65％，15/85)为cap8型，其余14株菌(16.47％，14/85)为非cap5和非cap8。cap5为优势血清型。
　　用琼脂稀释法检测了金黄色葡萄球菌对30种抗生素的敏感性，结果表明85株分离菌株对万古霉素、阿莫西林/克拉维酸、头孢喹肟、亚胺培南、阿米卡星均为敏感菌株;对下列药物的MIC表型变现为耐药率超过50％:青霉素(67.06％)、氨苄西林(64.71％)、阿莫西林(94.12％)、四环素(60.00％)、萘啶酸(97.65％)、复方新诺明(77.65％)、林可霉素(61.18％)、红霉素(94.12％)、阿奇霉素(94.12％)和喹乙醇(96.47％)。所有金黄色葡萄球菌分离菌株表现出至少耐2类不同的抗生素。多重耐药菌中以耐8类不同抗生素的菌株数量最多(n=30)，其次是耐9类不同抗生素(n=19)和耐5类不同抗生素(n=18)。24株凝固酶阴性金黄色葡萄球菌均为多重耐药菌。12.5％(3/24)的菌株为4重耐药菌;33.33％(8/24)的菌株为5重耐药菌;6重耐药菌和7重耐药菌均只有4.17％(1/24);45.83％(11/24)的菌株为8重耐药菌。
　　金黄色葡萄球菌检测的95个耐药基因中，阳性基因有55个(57.89％，55/95)，其余40个(42.11％，40/95)基因为阴性。阳性耐药基因中携带率为100％的有13个，分别为emB,emX,etK,InuA/A'，InuA,grlA,grlB,ant4'-Ia,class1,norA,norB,norC，mepA;另有携带率≥90％的耐药基因11个，分别为pbp4，ermB，ermC，ermT，tet38，gyrA，gyrB，cat:pc221，aphA3，dfrA(S1)，dfrG。这些耐药基因主要的耐药抗生素类别和耐药机制表现为青霉素类，β-内酰胺类，四环素类，林可酰胺类，氟喹诺酮类，氨基糖苷类，TMP，外排泵和整合子。
　　金黄色葡萄球菌检测的66个毒力因子中，阳性因子有45个(68.18％，45/66)，其余21个(31.82％，21/66)因子为阴性。以下12个毒力因子在分离菌株中携带率为100％: hla，hlgv，hld; lukED; lbp; bbp; sak; efb，fnbA，clfA，clfB，ebp。与TSST-1(Toxic shock syndrome tosin)相关的毒力因子tst的检测结果为阴性。
　　经过MLST分析，85株金黄色葡萄球菌分离菌共得到了6个STs:ST5(n=30，35.29％), ST7(n=24,28.23％), ST9(n=16,18.82％), ST398(n=7,8.24％), ST464(n=1，1.18％)，ST2750(n=1，1.18％);其余6株菌(7.06％)没有得到具体的ST型。ST5、ST7和ST9为优势型;仅ST5同时存在于三种不同动物源的分离菌中。在凝固酶阴性金黄色葡萄球菌中，ST5(54.17％)和ST7(33.33％)是优势型。
　　4株菌携带了mecA，成为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin，MRSA)，来源分别为河南省鸡源1株（该菌株同时为凝固酶阴性菌株），湖北省猪源1株，湖南省猪源2株。3株MRSA为cap5，另1株MRSA对cap5和cap8均为阴性。2株MRSA为ST7，2株MRSA为ST9。它们均为多重耐药菌:来自河南省鸡源菌表现为八重耐药菌;来自湖北省猪源菌为五重耐药菌;来自湖南省猪源的2株菌均为九重耐药菌。同时，这些MRSA携带了其他46个(83.64％，46/55)阳性耐药基因。
　　将85株金黄色葡萄球菌的血清型，ST型和多重耐药性进行联系，结果表明，血清型为cap5的菌株在5种不同的STs中均有分布，以ST5和ST9中的数量最多;血清型为cap8的菌株表现为3种不同的STs，以ST7中的数量最多。ST5型菌株主要表现为四重耐药菌和五重耐药菌;ST7型菌株主要表现为八重耐药菌;ST9和ST398的菌株主要表现为九重耐药菌。
　　4.华中地区畜禽空肠弯曲杆菌的流行性研究
　　从2185份采集的健康动物样品中鉴定出18株空肠弯曲杆菌，分别来自鸡源(n=6)和猪源(n=12)。用琼脂稀释法检测了空肠弯曲杆菌对27种抗生素的敏感性，结果表明，对多西环素和四环素的耐药率均为100％;对环丙沙星、红霉素的耐药率分别为66.67％和88.87％;对其他的抗生素也表现出了较高的耐药性。
　　综上所述，来自河南省、湖北省和湖南省养殖场（鸡、猪和奶牛）健康动物中均能分离到沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌。它们的血清型呈现多样性;对目前兽医临床上使用的不同类抗生素均有不同的敏感性，已经有耐药菌(含多重耐药菌）的存在;分离菌株携带了各类不同的耐药基因和基因移动元件;它们都含有功能不同的毒力基因；基因型也表型出多样性。因此，在兽医临床上应对抗生素的使用进行长期监测，为控制和合理的使用抗生素提供基础信息；也从源头管控动物健康和食品安全。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 立题依据

1．2 目的和意义

2．畜禽沙门氏菌耐药和毒力的流行性及分子特性研究

2．1 材料与试验方法

2．1．1 培养基、试剂和药物

2．1．2 培养基与试剂配制

2．1．3 药物配制

2．1．4 实验仪器

2．1．5 样品采集

2．1．6 沙门氏菌的分离

2．1．7 沙门氏菌的鉴定

2．1．8 菌株的保存

2．1．9 血清型鉴定

2．1．10 抗生素敏感性实验

2．1．11 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的表型筛选和确定

2．1．12 耐药因子检测

2．1．13 毒力因子检测

2．1．14 多位点基因序列分型(Multi Locus Sequence Typing，MLST)

2．1．15 数据分析

2．2 结果

2．2．1 细菌的分离和鉴定

2．2．2 血清型结果

2．2．3 抗生素敏感性试验结果与ESBLs(MIC法)结果

2．2．4 耐药基因检测结果

2．2．5 毒力基因检测结果

2．2．6 MLST的结果

2．3 讨论

2．3．1 沙门氏菌的分离

2．3．2 沙门氏菌的血清型和基因型(MLST)

2．3．3 沙门氏菌的抗生素敏感性试验

2．3．4 ESBLs的检测

2．3．5 沙门氏菌耐药基因

2．3．6 沙门氏菌毒力基因

2．4 小结

3．畜禽金黄色葡萄球菌耐药和毒力的流行性及分子特性研究

3．1 材料与试验方法

3．1．1 培养基、试剂和药物

3．1．2 培养基与试剂配制

3．1．3 药物配制

3．1．4 实验仪器

3．1．5 样品采集

3．1．6 金黄色葡萄球菌的分离

3．1．7 金黄色葡萄球菌的鉴定

3．1．8 菌株保存

3．1．9 血浆凝固酶试验

3．1．10 血清型鉴定

3．1．11 抗生素敏感性试验

3．1．12 耐药因子检测

3．1．13 毒力因子检测

3．1．14 多位点序列分析(Multi Locus Sequence Typing，MLST)

3．1．15 数据分析

3．2 结果

3．2．1 细菌的分离和鉴定

3．2．2 血浆凝固酶试验结果

3．2．3 血清型结果

3．2．4 抗生素敏感性试验结果

3．2．5 耐药因子检测结果

3．2．6 毒力因子检测结果

3．2．7 MLST结果

3．3 讨论

3．3．1 金黄色葡萄球菌分离(含MRSA)，血清型和MLST

3．3．2 抗生素敏感性试验

3．3．3 耐药基因检测

3．3．4 毒力基因检测

3．4 小结

4．畜禽空肠弯曲杆菌流行性研究

4．1 材料与试验方法

4．1．1 培养基、试剂和药物

4．1．2 培养基与试剂配制

4．1．3 药物配制

4．1．4 实验仪器

4．1．5 样品采集

4．1．6 空肠弯曲杆菌的分离

4．1．7 空肠弯曲杆菌的鉴定

4．1．8 抗生素敏感性试验

4．2 结果

4．2．1 空肠弯曲杆菌分离和鉴定结果

4．2．2 抗生素敏感性试验结果

4．3 讨论

4．3．1 空肠弯曲杆菌的分离

4．3．2 抗生素敏感性试验

4．4 小结

5．养殖场使用抗生素的调查

6．不同环境中的抗生素耐药性(综述)

参考文献

致谢

作者简介

附录