二化螟V-ATPaseA基因的克隆及其与Cry蛋白结合能力分析

摘要

二化螟 Chilo suppressalis(walker)是我国水稻上的重要害虫之一，目前，二化螟的防治主要依靠化学杀虫剂。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）产生的Cry晶体蛋白对鳞翅目害虫具有较好的防治效果，Cry基因也是目前转基因水稻开发应用最重要的抗虫基因之一。研究Cry晶体蛋白对二化螟的作用机制，在探寻有效的二化螟防治策略方面具有重要的理论和应用价值。Cry晶体蛋白通过与鳞翅目昆虫中肠受体结合而起作用，目前鳞翅目昆虫的Cry晶体蛋白受体主要有类钙粘蛋白、氨肽酶 N和碱性磷酸酯酶等。有研究报道V-ATPase A是烟蚜夜蛾Cry1Ac结合蛋白，因此，本文通过RT-PCR结合 RACE技术克隆了二化螟V-ATPase A基因的序列全长，利用DNAMAN等软件对该基因进行多序列比对和进化树构建来分析与其他物种的关系；采用大肠杆菌表达系统对V-ATPase A基因成功的进行了表达，并通过与其它Cry晶体蛋白的竞争性结合实验分析了V-ATPaseA基因的功能。
　　本研究主要内容包括：⑴采用RT-PCR结合RACE技术克隆并获得了二化螟V-ATPase A基因的cDNA序列全长，该基因序列全长为2079bp，其中5'端非编码区为94bp，3'端非编码区为131bp，编码区为1854bp。预测蛋白分子量为68.123KD，等电点为5.21。序列比对分析发现，该序列与玉米螟V-ATPase A的相似度最高。⑵利用大肠杆菌表达系统获得了V-ATPase A基因的体外表达蛋白，将表达的蛋白分别与生物素标记的Cry1Ac、Cry2Aa、Cry1Ca晶体蛋白进行了点杂交实验，实验结果表明表达的蛋白可以与Cry1Ac、Cry2Aa、Cry1Ca结合，此外，竞争性结合实验结果表明，三个Cry蛋白之间在与V-ATPase A外源表达蛋白的结合过程中没有明显的竞争关系。

目录

声明

第一章 前言

1.1二化螟发生及危害

1.2苏云金芽孢杆菌简介

1.3 Bt蛋白作用机理

1.4昆虫中肠Cry蛋白受体

1.5 V-ATP酶简介

1.6 本论文研究的目的和意义

第二章 研究内容和技术路线

2.1 主要研究内容

2.2 研究技术路线

第三章 二化螟V-ATPase A的基因克隆及序列分析

3.1实验材料

3.2 二化螟V-ATPase A基因克隆

3.3 基因克隆结果及其序列分析

第四章 V-ATPase A基因的原核表达

4.1材料和试剂

4.2 实验方法

4.3 结果分析

第五章 讨论

5.1全文结论

5.2本文创新点

5.3不足及展望

参考文献

致谢