二化螟Cry1C耐受品系的适合度及其中肠BBMV与Bt蛋白的结合能力研究

摘要

鳞翅目昆虫二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上主要的蛀茎害虫，给我国水稻生产造成了巨大的损失。转Bt基因水稻的研发为水稻鳞翅目害虫防治带来了新的策略，但也带来了靶标害虫潜在的抗性风险等问题。二化螟抗性问题是转基因水稻生态安全评价重点关注的内容之一，也是制约转基因水稻可持续应用的关键因素。目前，转Bt基因水稻靶标害虫二化螟对Bt杀虫蛋白的抗性发展及抗性机理尚不明确。通过室内筛选建立二化螟Bt抗性品系，研究其抗性演化规律，探究二化螟抗性产生后适合度变化及其抗性产生的生化机理，可为靶标害虫的抗性风险评价和抗性治理提供科学数据和理论依据，具有重要研究意义。 目前，实验室已经建立了成熟的二化螟室内饲养技术，并利用Cry1C杀虫蛋白对二化螟敏感品系进行继代汰选，获得了Cry1C耐受品系。在此基础上，通过研究二化螟Cry1C耐受和敏感品系在不合Bt杀虫蛋白的人工饲料上的适合度差异;并使用cry1C+cry1Ab、cry1Ab、cry1C三种转基因抗虫水稻及亲本MH63水稻离体叶片饲喂二化螟两个品系，比较两品系在转基因抗虫水稻上的适合度差异;利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)比较二化螟Cry1C耐受和敏感品系中肠BBMV与Cry1C蛋白的结合能力，探究二化螟抗性产生与结合能力变化的关系。主要研究结果如下: 1.室内继代汰选与二化螟敏感品系具有相同遗传背景的二化螟Cry1C耐受品系，研究表明，经过连续41代的抗性筛选，二化螟Cry1C抗性倍数达到了42.59倍。同时，研究了两品系在不含Bt杀虫蛋白的人工饲料上的适合度差异，结果表明，与二化螟敏感品系相比，二化螟Cry1C耐受品系幼虫历期和蛹历期显著延长，幼虫8日龄和12日龄体重也显著低于敏感品系。同时，二化螟Cry1C耐受品系的成虫历期显著低于敏感品系。但两品系的化蛹率、羽化率、单雌产卵量、孵化率、卵历期和3日龄蛹重都差异不显著。 2.采用离体水稻叶片生测的方法，就二化螟Cry1C耐受和敏感品系在转基因抗虫水稻不同生育期适合度进行了比较研究。结果表明，二化螟敏感品系对三种转基因抗虫水稻高度敏感，而二化螟Cry1C耐受品系在cry1C水稻5个生育期第6天死亡率显著高于敏感品系，并有部分幼虫进入2龄。而Cry1C耐受和敏感品系在cry1C+cry1Ab水稻、cry1Ab水稻5个生育期的死亡率均达99％以上。可见，二化螟Cry1C耐受品系已明显对cry1C水稻有一定适应，对Cry1C杀虫蛋白表现较高的耐受性;但Cry1C耐受品系仍对cry1Ab和cry1C+cry1Ab水稻高度敏感，也进一步说明了Cry1C耐受品系与Cry1Ab蛋白没有交互抗性。ELISA法测定了三种抗虫水稻5个生育期叶片Bt蛋白表达量，发现Cry1C耐受种群在Bt水稻上的校正死亡率与Cry1C杀虫蛋白的表达量正相关，说明随着Cry1C蛋白表达水平的增高，其杀虫效果也逐渐提高。 3.利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)比较了二化螟Cry1C耐受和敏感品系中肠BBMV与Cry1C蛋白的结合能力。结果表明，二化螟敏感品系中肠BBMV与Cry1C解离常数Kd=17.20±2.68nmol，结合位点浓度Bmax=1.66±0.08nM，而Cry1C耐受品系中肠BBMV与Cry1C解离常数Kd=20.36±4.98nmol，结合位点浓度Bmax=1.54±0.13nM。低水平抗性下，二化螟Cry1C耐受品系中肠BBMV与Cry1C蛋白的结合能力与敏感品系相比没有显著差异，说明在该抗性水平下，二化螟对Cry1C杀虫蛋白抗性的产生并没有改变中肠BBMV与Cry1C杀虫蛋白结合能力。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1转基因作物的研究进展

1．1转基因作物应用现状

1．2转基因抗虫水稻研发现状

1．3转基因抗虫水稻主要靶标害虫及其生物学特性

1．4转基因作物潜在的环境生物安全性

2 Bt蛋白靶标害虫抗性研究进展

2．1 Bt蛋白靶标害虫抗性发展现状

2．2 Bt蛋白靶标害虫抗性机理

3 Bt抗性昆虫的适合度研究

4 Bt抗性综合治理策略

4．1高剂量／庇护所策略

4．2多基因策略

5本研究内容及意义

5．1研究内容

5．2研究意义

5．3技术路线

第二章二化螟Cry1C耐受品系汰选及其在人工饲料上适合度研究

1材料与方法

1．1供试虫源

1．2供试蛋白

1．3主要试剂耗材及仪器设备

1．4二化螟Cry1C耐受品系的继代汰选

1．5二化螟生物测定

1．6二化螟适合度调查

1．7数据处理与分析

2结果与分析

2．2二化螟Cry1C耐受和敏感品系各虫态存活率及繁殖力差异比较

2．3二化螟Cry1C耐受和敏感品系各虫态历期差异比较

2．4二化螟Cry1C耐受和敏感品系不同日龄幼虫体重和蛹重比较

3讨论

第三章二化螟Cry1C耐受和敏感品系在Bt水稻上的适合度研究

1材料与方法

1．1供试虫源

1．2供试水稻

1．3主要试剂耗材及仪器设备

1．4转Bt水稻不同生育期离体叶片生测

1．5转Bt水稻不同生育期Bt蛋白表达量测定

1．6数据处理与分析

2结果与分析

2．1二化螟Cry1C耐受和敏感品系在Bt水稻上6天存活率调查

2．3二化螟Cry1C耐受和敏感品系在Bt水稻上的死亡率

2．3转Bt水稻不同生育期叶片Cry1C和Cry1Ab蛋白表达量

2．4 Bt水稻中Cry1C蛋白表达量与二化螟死亡率的相关分析

3讨论

第四章二化螟Cry1C耐受和敏感品系中肠BBMV与Cry1C蛋白结合能力研究

1材料与方法

1．1供试虫源

1．2供试Bt蛋白

1．3主要试剂耗材及仪器设备

1．4二化螟中肠BBMV的提取

1．5 BBMV活性检测

1．7 ELISA法测定二化螟中肠BBMV与Cry1C蛋白结合能力

1．8数据处理与分析

2结果与分析

2．1 BBMV活性分析

2．3二化螟Cry1C耐受和敏感品系中肠BBMV与Cry1C蛋白结合能力分析

3讨论

第五章全文总结

1结论

2论文创新点

3不足和展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文