干酪乳杆菌表达载体的构建及异源蛋白的表达

摘要

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是传统的发酵工业用菌株，因其食品级的安全特性备受青睐。目前已有一些生产蛋白，酶类和代谢产物的重组乳酸菌菌株的报道。但与大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母表达系统等相比，乳酸菌特别是乳杆菌表达系统目前还处于研究阶段。
　　本研究以干酪乳杆菌MCJΔ1为对象，在本研究室已构建的乳酸菌胞内表达载体pELX1的基础上，以人表皮生长因子(EGF)，大豆多肽lunasin，黑曲霉壳聚糖外切酶（Csx），壳聚糖内切酶（Csn）和壳聚糖内外切重组酶（Csx-n），枯草芽孢杆菌纳豆激酶(NK)，短小芽孢杆菌甘露聚糖酶(Man)，大肠杆菌K12β-D-葡糖醛酸酶（GusA），干酪乳杆菌ATCC334β-半乳糖苷酶(β-gal)，干酪乳杆菌ATCC3936-磷酸-β-半乳糖苷酶(LacG)，冰岛硫化叶菌腺苷甲硫氨酸合成酶(Smat)，手足口病抗原蛋白VP1共12种基因为目的基因来测试干酪乳杆菌表达载体pELX1的通用性。经SDS-PAGE和Western blot分析，有四种蛋白，即Man，GusA，β-gal和LacG得到了正确表达，且都属于原核生物的蛋白。由此推论干酪乳杆菌表达载体pELX1具有一定表达通用性，易于表达原核生物蛋白。经酶活测定，重组菌甘露聚糖酶酶活最大可达23U/mg总蛋白;β-D-葡萄糖醛酸酶酶活最大为75U/mg总蛋白。测得Man和GusA在干酪乳杆菌MCJΔ1的不同生长时期的酶活，结果表明，Man比GusA更适合作为干酪乳杆菌的定量报告蛋白。
　　在干酪乳杆菌胞内表达载体pELX1的基础上，利用乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的信号肽(SPusp45)及嗜酸乳杆菌的S层蛋白SlpA为分泌信号，构建了分泌表达载体pELSH和细胞表面锚定载体pELWH。以Man为报告基因分别测试这两个载体的表达状况。经Western blot分析，在pELSH-Man-MCJΔ1重组菌培养基上清液中可检测到大量的Man蛋白;在pELWH-Man-MCJΔ1重组菌胞内和细胞表面能检测到Man蛋白，但在培养基上清液中未检测到Man蛋白。以上结果表明，pELSH是分泌表达载体，pELWH是细胞表面锚定载体。酶活测定发现，pELSH-Man-MCJΔ1分泌蛋白表达量最大为8800U/L，分泌效率达80％; pELWH-Man-MCJΔ1重组菌株锚定Man蛋白表达量最大为28mU/5×109cfu。。
　　该表达系统的构建为更多异源蛋白在干酪乳杆菌中的表达提供了可能，也为干酪乳杆菌作为活菌疫苗抗原传递载体提供了理论基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 乳酸菌概述

1．2 乳酸菌基因工程研究

1．3 干酪乳杆菌作为活菌疫苗呈递载体的优势

1．4 乳酸菌表达载体

1．4．1 染色体整合载体

1．4．2 质粒载体

1．4．3 启动子

1．4．4 信号肽

1．4．5 细胞靶向锚定序列

1．5 报告基因

1．6 甘露聚糖酶研究进展

1．7 本研究的背景、目的意义及技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 主要化学药品

2．1．3 主要化学试剂

2．1．4 培养基及其成分

2．1．5 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 pELX1-gene重组质粒的构建

2．2．2 目的基因在大肠杆菌JM109中表达的目的蛋白的检测

2．2．3 重组质粒pELX1-gene电转化干酪乳杆菌MCJ△1

2．2．4 目的基因在干酪乳杆菌MCJ△1中表达的目的蛋白的检测

2．2．5 分泌表达载体pELSH的构建

2．2．6 重组质粒pELSH-Man的构建

2．2．7 重组质粒pELSH1Man在大肠杆菌JM109中的表达及蛋白检测

2．2．8 重组质粒pELSH-Man在干酪乳杆菌MCJA1中表达及目的蛋白的检测

2．2．9 锚定表达载体pELWH的构建

2．2．10 重组质粒pELWH-Man的构建

2．2．11 重组质粒pELWH-Man在大肠杆菌JM109中表达的目的蛋白的检测

2．2．12 重组质粒pELWH-Man在干酪乳杆菌MCJ△1中表达的目的蛋白的检测

3 结果与分析

3．1 pELX1-gcne重组质粒的构建

3．2 pELX1-gene在大肠杆菌JM109中的表达

3．3 pELX1-gene在千酪乳杆菌MCJ△1中的表达

3．4 pELSH、pELSH-Man重组质粒的构建

3．5 pELSH-Man在千酪乳杆菌MCJ△1中的表达

3．6 分泌表达Man的重组干酪乳杆菌在以魔芋精粉为唯一碳源的MRSK中的生长

3．7 pELWH、pELWH-Man重组质粒的构建

3．8 pELWH-Man在干酪乳杆菌MCJ△1中的表达

4 讨论

参考文献

附录

攻读硕士期间的学术成果

致谢