海洋细菌Zunongwangia sp.海藻糖酶酶学分析及体外定向进化

摘要

海藻糖在自然环境的的微生物、植物和动物中广泛存在，包括细菌、真菌、昆虫、低等植物、脊椎动物。海藻糖酶是一种海藻糖水解酶，能够特异性的将海藻糖分解为两分子的葡萄糖。海藻糖酶在食品、农药设计和农业生产中有着潜在的价值，应用前景远大。本研究从海洋细菌Zunongwangia sp.中扩增得到一个新的海藻糖酶基因，并将其成功表达在大肠杆菌中，纯化重组海藻糖酶，且对它的酶学性质进行了分析。同时本研究利用随机突变技术对海藻糖酶基因进行了定向进化。本研究主要内容包括：
　　⑴从海洋细菌Zunongwangia sp.中克隆了一个新的海藻糖酶基因treZ。treZ是由1590 bp组成，G+C含量是36.98％，编码了529个氨基酸，分子量为61.3 kDa。通过BLAST比对发现TreZ属于糖苷水解酶第37家族。对TreZ的酶学性质进行分析，发现TreZ的最适反应pH是6.5，最适反应温度是50℃。在pH7.5和8.0缓冲液20℃处理48h后，TreZ分别还保持大约141％和147％的相对活性。TreZ表现极端的耐盐性，在1 M NaCl时有最大的活性（136％，相对活性），NaCl的浓度在0.5-3.5 M的时，TreZ能够保持100％以上的活性;NaCl的浓度为最大的5M时，TreZ还能保持55％的活性。TreZ在高浓度NaCl环境中具有很好的稳定性，在NaCl的浓度在0-4 M处理24 h后，TreZ的活性几乎没有丧失。Fe3+，Cu2+，Zn2+，ADP，Co2+，EDTA和ATP能够抑制海藻糖酶TreZ的活性， K+，Ni+，Mg2+，Ca2+和Ba2+增强TreZ的活性。TreZ海藻糖的Km是0.99 mmol/L，Vmax是0.176 mmol l-1 min-1，催化常数kcat是263.2 s-1。
　　⑵为了获得催化效率提高的酶，利用易错PCR技术建立突变体库，以及T7噬菌体裂解-96深孔板结合DNS的高通量的筛选体系。从8000个突变体中筛选到了三个活性提高的突变株B6，C4和D9。突变体B6，C4和D9的最适pH都是6.0，在pH5.5-7.5的范围内它们具有60％以上的活性，用pH6.0-8.0缓冲液处理后，酶十分稳定。B6和D9的最适温度是45℃，比野生型要低了5℃; C4的最适温度还是50℃，没有变化。突变体B6的Km是0.4197 mmol/L，比野生型的降低了57.6％，它的kcat值为154.41 s-1，比野生型的减少了41.3％。因此突变体B6的（kcat/ Km）比野生型增加了38.9％。突变体C4的Km是0.3793 mmol/L，比野生型的降低了61.7％，而它的kcat值为433.69 s-1，比野生型的增加了64.7％，（kcat/Km）显著增加了230％。突变体D9的Km是0.6811 mmol/L，比野生型的降低了31％，而它的kcat值为259.15 s-1，比野生型的减少了1.5％，它的(kcat/Km)增加了43.1％。
　　⑶突变体C4中有两个位点发生了突变227位(Y→H)和442位(R→G)。为了研究这两个点对酶催化效率的影响，对这两个位点分别进行定点突变。突变体酶Y227H的Km是0.7194 mmol/L，比野生型的降低了27.3％，它的kcat值为299.83 s-1，比野生型的增加了13.9％，（kca/ Km）增加了57％。突变体酶R442G的Km是0.4317mmool/L，比野生型的降低了56.4％，它的kcat值为319.88 s-1，比野生型的增加了21.5％，（kcat/Km）增加了178％。而突变体酶C4的（kcat/Km）催化效率与野生型相比增加了230％，突变体酶Y227H和R442G的（kcat/Km）催化效率与野生型相比分别增加了57％和178％，两者之和约为230％，也就说这两个位点的突变对突变体酶C4的（kcat/Km）催化效率显著的提高，都起到了关键作用。上述的研究为揭示海藻糖酶结构和功能之间的关系提供了有用的信息。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．前言

1．1 海藻糖

1．1．1 海藻糖的结构

1．1．2 海藻糖的分布

1．1．3 海藻糖的功能

1．1．4 海藻糖的分解代谢

1．2 海藻糖酶

1．2．1 海藻糖酶概述

1．2．2 海藻糖的分类

1．2．3 海藻糖酶的分子结构

1．2．4 海藻糖酶的作用机制

1．2．5 海藻糖酶的功能

1．3 海藻糖酶的基因的克隆和表达

1．4 海藻糖酶的结构和突变研究

1．5 海藻糖酶的应用

1．5．1 海藻糖在食品中的潜在应用

1．5．2 海藻糖酶在农业中的潜在应用

1．5．3 海藻糖酶结构位点研究在农药中的应用

1．6 本研究的目的与意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 溶液

2．1．5 仪器设备

2．2 海藻糖酶基因treZ的获得方法

2．2．1 海洋细菌Zunongwangia sp．基因组DNA的抽提

2．2．2 克隆treZ基因

2．2．3 PCR产物纯化、回收与酶切

2．2．4 碱裂解抽提细菌的质粒DNA

2．2．5 构建pGEX-6p-treZ重组表达载体

2．2．6 大肠杆菌感受态的制备

2．2．7 电转化

2．2．8 检测阳性克隆子

2．3 TreZ的表达与纯化

2．3．1 感受态的制备

2．3．2 treZ的诱导表达

2．3．3 SDS-PAGE凝胶的配制

2．3．4 TreZ蛋白的纯化

2．3．5 蛋白浓度测定

2．4 海藻糖酶的酶学性质

2．4．1 标准曲线的绘制

2．4．2 海藻糖酶的酶活测定方法

2．4．3 海藻糖酶的最适反应温度

2．4．4 海藻糖酶的热稳定性

2．4．5 海藻糖酶的最适pH

2．4．6 海藻糖酶的pH稳定性

2．4．7 海藻糖酶的底物特异性

2．4．8 金属离子和化合物对海藻糖酶的影响

2．4．9 酶动力学性质的测定

2．5 treZ基因随机突变体库的构建

2．5．1 易错PCR扩增基因treZ

2．5．2 易错PCR产物的纯化、回收与酶切

2．5．3 酶连

2．5．4 电转化

2．5．5 抽提重组质粒

2．5．6 随机突变库的筛选方法

2．5．7 突变株蛋白的诱导表达和纯化

2．5．8 突变菌株的基本酶学性质测定

2．5．9 突变型菌株的酶动力学常数

2．6 定点突变

2．6．1 引物设计

2．6．2 定点饱和突变

2．6．3 定点突变菌株的表达和纯化

2．6．4 定点突变菌株的酶学性质

2．7 酶的三维结构的模拟

3．结果与分析

3．1 海洋细菌Zunongwangia sp．基因组DNA的提取

3．2 PCR扩增treZ基因

3．3 pGEX-6p-treZ重组质粒的构建

3．4 treZ基因及其蛋白序列分析

3．5 TreZ蛋白的表达和纯化

3．6 TreZ的酶学性质的分析

3．6．1 葡萄糖标准曲线的绘制

3．6．2 酶的最适反应pH和pH耐受性

3．6．3 酶的最适反应温度和热稳定性

3．6．4 TreZ的底物特异性

3．6．5 NaCl对海藻糖酶TreZ酶活的影响

3．6．6 金属离子和化合物对海藻糖酶TreZ活性的影响

3．6．7 TreZ的动力学参数测定

3．7 treZ基因的随机突变库的构建

3．7．1 易错PCR法扩增treZ基因

3．7．2 易错PCR突变体库重组质粒的检测

3．7．3 突变体库突变频率的分析

3．7．4 高活性突变株的筛选

3．7．5 突变型酶的诱导纯化表达

3．7．6 突变体蛋白的酶学性质分析

3．8 酶的结构模拟

3．9 定点突变

3．8．1 定点突变质粒的获得

3．9．2 定点突变酶的诱导表达

3．9．3 定点突变酶的最适pH和pH耐受

3．9．4 定点突变酶的最适温度和热稳定性

3．9．4 定点突变体的酶动力学分析

4 讨论

4．1 野生型海藻糖酶的TreZ的分析

4．2 突变体的分析

4．2．1 随机突变体的分析

4．2．2 定点突变体的分析

参考文献

研究成果

致谢