蜻蜓凤梨中两个开花相关的AFAP2基因的克隆与功能分析

摘要

蜻蜓凤梨（Aechmea fasciata）隶属凤梨科，为多年生草本单子叶植物，很具有观赏价值。因其营养生长期较长，开花时间难以预测，故一直以来通过控制外源环境温度、光照和施用激素等人工催花技术使其开花时间整齐统一是满足市场需求的重要方法和手段，但到目前为止，凤梨开花机理仍然未知，导致人工催花效果并不理想。本文以蜻蜓凤梨（Aechmea fasciata）为对象，通过对蜻蜓凤梨转录组数据的分析，获得两个跟拟南芥AP2同源片段，利用RACE技术首次从蜻蜓凤梨中克隆到完整的AfAP2-1和AfAP2-2序列，其中蜻蜓凤梨AfAP2-1 cDNA序列全长2057 bp，开放阅读框全长1362 bp，编码453个氨基酸。AfAP2-2的cDNA全长2185 bp，开放阅读框全长1404 bp，编码467个氨基酸。保守结构域分析AfAP2-1和AfAP2-2均含有两个AP2结构域，属于AP2/EREBP家族成员。系统进化树分析发现AfAP2-1和AfAP2-2蛋白均与拟南芥的AP2 RAP2.7亲缘关系较近。
　　本研究主要内容包括：⑴酵母单杂交技术验证，AfAP2-1和AfAP2-2均具有转录激活功能，进一步研究发现其转录激活功能均在不含AP2结构域的C端。⑵利用荧光实时定量技术，对蜻蜓凤梨本身小株和大株中AfAP2-1和AfAP2-2的24小时表达量进行分析，显示AfAP2-1在小株中的表达量高，AfAP2-2在大株中的表达量高。⑶利用AfAP2-1和AfAP2-2的CDS序列构建了CaMV35S-AfAP2-1和CaMV35S-AfAP2-2过表达载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥植株，再利用GUS染色和RT-PCR鉴定转基因阳性植株。35S::AfAP2-1拟南芥阳性植株表现出明显的延迟开花的表型，35S::AfAP2-2拟南芥植株表现出花器官内轮发育异常、种子败育以及茎发育异常的表型。该研究初步验证了AfAP2-1和AfAP2-2的功能，表明蜻蜓凤梨AfAP2-1和AfAP2-2参与开花时间调控以及花器官发育途径，对深入研究凤梨科植物开花调控的分子机理具有重要意义。

目录

声明

中英文缩略语

1 前言

1.1问题由来

1.2文献综述

1.2.1开花基因调控网络

1.2.2 AP2/EREBP转录因子家族成员的结构与分类

1.2.3 AP2亚家族的功能

1.2.4 EREBP亚家族的功能

1.2.5 RAV亚家族和其他一些成员的功能

1.2.6 酵母单杂交原理

1.3 研究的目的意义

2.1 材料

2.1.1 植物材料与菌种质粒

2.1.2 药品与试剂

2.2 方法

2.2.1 目的基因的克隆

2.2.2 转录活性的验证

2.2.3昼夜表达节律性

2.2.4目的基因过表达载体的构建

2.2.5 遗传转化拟南芥

3结果与分析

3.1 AfAP2-1和AfAP2-1基因的克隆及序列分析

3.1.1蜻蜓凤梨RNA的提取

3.1.2 AfAP2-1和AfAP2-2编码区序列的获得

3.1.3 AfAP2-1和AfAP2-2的生物信息学分析

3.2 AfAP2-1和AfAP2-2的转录激活作用

3.2.1 酵母过表达载体构建分析

3.2.2 目的基因转录激活作用分析

3.3 AfAP2-1和AfAP2-2的昼夜节律表达分析

3.3.1 荧光定量引物检测结果

3.3.2溶解曲线分析

3.3.3 AfAP2-1的昼夜节律表达分析

3.3.4 AfAP2-2的昼夜节律表达分析

3.4 AfAP2-1和AfAP2-2的功能鉴定

3.4.1 AfAP2-1和AfAP2-2的过表达载体构建

3.4.2 拟南芥转基因阳性苗的GUS检测结果与分析

3.4.3 AfAP2-1和AfAP2-2转基因拟南芥阳性苗的分子水平鉴定

3.4.5 35S::AfAP2-1和35S::AfAP2-2表型分析

4讨论

4.1 AfAP2-1和AfAP2-2可能参与光周期调控开花

4.2 AfAP2-1和AfAP2-2功能上的差异性

参考文献

附录

致谢