敲低Dnmt1和Dnmt3b对小鼠胚胎成纤维细胞凋亡、周期和基因组DNA甲基化水平的影响

摘要

供体细胞不完全重编程被认为是体细胞核移植效率低下的主要原因，甲基转移酶1（Dnmt1）和甲基转移酶3b（Dnmt3b）在早期胚胎发育中的正确表达对胚胎后期发育有重要影响。研究发现这两种酶在胚胎附植前表达较少，而体细胞核移植胚胎中表达比体内正常胚胎高。在癌细胞的研究中发现，同时干扰两者更能降低基因组甲基化水平，而在体细胞中同时干扰Dnmt1、Dnmt3b会给细胞带来何影响还未见报道。
　　本实验以小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)为实验对象，用RNA干扰（RNAi）方法对MEF Dnmt1和Dnmt3b进行干扰，研究分别干扰和同时干扰这两个基因对细胞凋亡、周期、甲基化水平的影响。实验组随机分为Dnmt1干扰组(80nM)、Dnmt3b干扰组(80nM)、NC-Dnmt1/Dnmt3b组(80nM)、Dnmt1+Dnmt3b干扰组(80+80nM)、NC-Dnmt1+Dnmt3b(80+80nM)及空白对照组;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测Dnmt1、Dnmt3b和PCNA(proliferatingcell nuclear antigen，增殖细胞核抗原)mRNA表达;蛋白免疫印记(Western Blot)检测各实验组DNMT1、DNMT3b蛋白变化情况;用凋亡、周期试剂盒分别检测细胞凋亡、周期情况;DNA甲基化定量检测试剂盒检测细胞基因组DNA总体甲基化水平。主要结果如下:
　　1.干扰后24h，提取细胞总RNA进行q-PCR检测mRNA水平发现，与阴性对照组(NC)比较，单独干扰Dnmt1使其mRNA下降69.6％，单独干扰Dnmt3b使其mRNA水平下降63.1％;与同时干扰组的NC相比，同时干扰组Dnmt1 mRNA下降60.1％，Dnmt3b mRNA下降63.4％; Dnmt1干扰显著降低了单独干扰组DNMT1蛋白约48％(P＜0.01)，干扰Dnmt3b也使其同时干扰组蛋白表达下降20％（P＜0.01）;
　　2.干扰后24h，Dnmt3b干扰组PCNA mRNA水平显著降低(P＜0.05），同时干扰组PCNA mRNA下降极显著（P＜0.01）。推测干扰Dnmt3b以及同时干扰Dnmt1和Dnmt3b抑制了MEFs细胞增殖;
　　3.干扰后48h用流式细胞仪检测细胞凋亡变化，与NC组相比，干扰Dnmt3b显著诱导细胞凋亡（P＜0.05），同时干扰组显著诱导中晚期凋亡和总凋亡（P＜0.01）;同时干扰组p53蛋白表达显著升高（P＜0.05）;
　　4.检测siRNA干扰后48h对MEFs细胞周期影响发现，同时干扰组处于G1期、G2期细胞增加，S期细胞减少(P=0.087)，差异不显著;
　　5.检测转染后48h基因组DNA甲基化水平发现，单独干扰Dnmt3b使基因组甲基化水平下降32％（P＜0.01），同时干扰组基因组甲基化水平下降约44％，差异极显著(P＜0.01)。干扰Dnmt1没有使基因组甲基化水平下降。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 体细胞核移植

1．2．2 小鼠体细胞核移植

1．2．3 体细胞核移植效率低的原因

1．2．4 表观重编程研究概况

1．2．5 正常发育过程中的表观重编程

1．2．6．DNA甲基化的作用和机制

1．3 研究目的与意义

2．材料和方法

2．1 本研究的技术路线

2．2 主要实验材料

2．2．1 实验细胞

2．2．2 主要试剂、试剂盒、抗体

2．2．3 主要试剂的配制

2．2．4 主要仪器设备

2．2．5 引物及siRNA列表

2．2．6 主要生物学数据库网站

2．3 实验方法

2．3．1 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的分离和培养

2．3．2 MEFs的siRNA转染

2．3．3 实时荧光定量PCR(q-PCR)

2．3．4 WB检测蛋白表达

2．3．5 细胞凋亡检测

2．3．6 细胞周期检测

2．3．7 细胞基因组甲基化检测

2．3．8 统计学方法

3．结果与分析

3．1 MEFs的siRNA转染

3．1．1 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的培养

3．1．2 转染效果

3．2 q-PCR检测干扰后24h Dnmt1、Dnmt3b mRNA表达情况

3．2．1 PCR引物及退火温度的确定

3．2．2 q-PCR检测mRNA水平干扰效果

3．3 siRNA干扰对DNMT1和DNMT3b蛋白影响

3．4 q-PCR检测干扰后增殖相关基因PCNA mRNA水平

3．5 细胞凋亡检测结果

3．6 细胞周期检测结果

3．7 基因组甲基化水平检测结果

4．讨论

4．1 MEFs的siRNA转染

4．2 siRNA干扰MEFs Dnmt1、Dnmt3b引起基因组甲基化变化

4．3 敲低Dnmt1、Dnmt3b引起MEFs增殖、凋亡、周期变化

5．小结

5．1 本研究主要结论

5．2 本研究的创新点

参考文献

致谢