参与mTRO活性调控的G蛋白鉴定及猪源T1R1/T1R3感应氨基酸筛选和功能研究

摘要

骨骼肌是动物机体的重要组成器官，是肉质生产中的重要的经济性状，也是人体蛋白质营养的主要来源。骨骼肌的生长主要取决于蛋白质的沉积，蛋白质沉积是蛋白质合成和降解的差值。mTOR是哺乳动物细胞蛋白质合成的核心调节因子，其活性受细胞内外的一系列信号调控，包括氨基酸、激素、生长因子和能量状态等。G蛋白偶联受体T1R1/T1R3是细胞膜上的一个重要的氨基酸感受器，能够感应胞外氨基酸，通过与其偶联的胞内G蛋白，调节细胞内的mTOR活性。T1R1/T1R3感应氨基酸具有种属特异性，鼠源T1R1/T1R3能感应多达18种L-氨基酸，人源T1R1/T1R3仅能感应L-谷氨酸和L-天冬氨酸，猪T1R1/T1R3最多可能感应6种L-氨基酸，包括L-谷氨酸和L-天冬氨酸，以及L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸和L-苏氨酸。因而，不同种属通过T1R1/T1R3调节mTOR活性的氨基酸种类也可能不一样。根据以上问题，本研究主要设计两个方面的实验，其一是鉴定与T1R1/T1R3偶联参与mTOR活性调控的G蛋白，其二是筛选猪源T1R1/T1R3感应氨基酸并验证其功能。得出的主要结果如下:
　　1、在C2C12和HEK-293细胞中，G蛋白Gi2参与T1R1/T1R3介导的氨基酸依赖性的mTOR活性调控。在C2C12和HEK-293细胞中，Gi2的突变激活显著(P＜0.05)促进了mTOR、mTOR下游靶蛋白p70S6K和mTOR上游激活因子ERK1/2的磷酸化水平，说明Gi2能够通过影响ERK1/2活性来参与mTOR活性调控;并且，Gi2的突变激活对AKT的磷酸化水平没有显著影响，说明Gi2对mTOR活性的影响不依赖于PI3K/AKT信号通路。Ca2+螯合剂BAPTA-AM处理会抵消Gi2的突变激活对mTOR、p70S6K和ERK磷酸化水平的促进作用，说明Gi2对mTOR活性的调节作用依赖于Ca2+信号。Gq的突变激活对mTOR及其下游靶蛋白p70S6K的磷酸化水平没有显著影响，说明在C2C12和HEK-293细胞中，Gq并不参与T1R1/T1R3介导的氨基酸依赖性的mTOR活性调控。
　　2、猪源T1R1/T1R3能够感应丝氨酸，调节mTOR活性。在HEK-293细胞中，当转染Gi2的突变激活质粒时，显著（P＜0.05）促进了ERK报告质粒的表达，但是不同氨基酸处理对ERK报告质粒表达的影响没有显著差异;当过表达T1R1和T1R3时，50mmol/L的丝氨酸孵育处理显著（P＜0.05）促进了ERK报告质粒的表达，说明猪源T1R1/T1R3能够感应丝氨酸，调节ERK活性。此外，过表达T1R1和T1R3时，蛋氨酸和亮氨酸处理对报告质粒表达的影响没有显著差异，说明猪源T1R1/T1R3不能感应蛋氨酸和亮氨酸。过表达T1R1和T1R3时，丝氨酸的添加会显著促进mTOR、S6K1和ERK1/2的磷酸化，其中10mmol/L的丝氨酸处理效果最为显著，说明丝氨酸能够通过ERK1/2调节mTOR活性。
　　综上所述，本研究的结论是:
　　1、T1R1/T1R3感应氨基酸，通过与其偶联的G蛋白Gi2调节mTOR活性;2、T1R1/T1R3感应氨基酸具有种属特异性，猪源T1R1/T1R3能够感应丝氨酸，调节ERK活性，进而影响mTOR的激活。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一部分 文献综述

1 前言

2 mTORC1信号

2．1 mTORC1的组成

2．2 mTORC1信号的调节

3 氨基酸信号对mTORC1的活性调节

3．1 参与mTORC1活性调节的氨基酸种类

3．2 氨基酸调节mTORC1活性的机制

4 G蛋白偶联受体T1R1／T1R3与mTOR信号调节

4．1 T1Rs的分类与功能

4．2 Ca2+与mTORC1信号

4．2 T1R1／T1R3参与mTORC1活性调节的机制

5 T1R1／T1R3通过G蛋白传递氨基酸信号

6 问题的提出与研究的目的意义

第二部分 参与mTOR信号调节的G蛋白鉴定

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 质粒测序

3．2 C2C12细胞、HEK-293细胞和猪骨骼肌中G蛋白mRNA表达定量分析

3．3 C2C12细胞中Gi2或Gq突变激活对mTORC1信号的影响

3．4 C2C12细胞中Gi2突变激活和Ca2+螯合剂BAPTA-AM处理对mTORC1信号的影响

3．5 HEK-293细胞中Gi2或Gq突变激活对mTORC1信号的影响

3．6 HEK-293细胞中Gi2突变激活和Ca2+螯合剂BAPTA-AM处理对mTORC1信号的影响

4 讨论

第三部分 猪源T1R1／T1R3感应氨基酸筛选

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 猪不同组织T1R1和T1R3的表达鉴定

3．2 猪源T1R1／T1R3过表达质粒构建

3．3 HEK-293细胞中猪源T1R1／T1R3感应氨基酸筛选

3．4 不同浓度丝氨酸处理对mTOR信号的影响

4 讨论

结语

1 研究结论

2 创新点

3 本研究不足之处

参考文献

致谢