狂犬病病毒L蛋白K1685和K1829对病毒致病性和免疫逃避的作用及机制

摘要

狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)引起的一种古老的人畜共患传染病，全世界每年约有55000人死于狂犬病，主要发生在非洲和亚洲一些发展中国家，我国是狂犬病高发国家之一。
　　RABV为单股负链RNA病毒，其基因组共编码五个结构蛋白，分别是N、P、M、G和L蛋白，其中L蛋白的研究甚少。通过对其它单股负链RNA病毒的L蛋白的相关研究，尤其是与RABV同属于弹状病毒科的水疱性口炎病毒(VSV)，表明L蛋白含有K-D-K-E的保守催化四聚体区域，该区域主要在病毒mRNA加帽过程中行使N-7和2'-O甲基转移酶(MTase)的功能，预计会在病毒的致病性及病毒逃逸宿主的先天性免疫中起到重要作用。
　　本研究首先利用在线软件ClustalW2对RABV、VSV、麻疹病毒、仙台病毒、新城疫病毒和尼帕病毒的L蛋白羧基端进行序列比对，结果表明RABV的L蛋白中也存在K-D-K-E四聚体区域，且四个关键氨基酸K、D、K、E是完全保守的。此外，进一步通过比较RABV不同毒株之间的L蛋白中的K-D-K-E四聚体区域，发现该保守区域在不同的RABV毒株间是高度保守的。
　　为了探索该K-D-K-E四聚体区域在RABV的致病性及逃逸宿主先天性免疫方面的作用，我们利用反向操作技术将该保守四聚体区域中的四个关键氨基酸位点K（第1685位）、D（第1797位）、K（第1829位）、E（第1867位）分别进行突变，构建一系列的重组狂犬病病毒(rRABV)，并将这些重组病毒与亲本病毒在致病性上进行体外和体内的比较。体外实验表明，D1797和E1867突变的rRABV(rB2c-K1797A和rB2c-K1867A)体外扩增2代时便会快速回复突变为亲本型，而K1685和K1829突变的rRABV(rB2c-K1685A和rB2c-K1829A)的遗传性状则比较稳定，细胞传代扩增至15代仍未发生回复突变，因此，本研究将以rB2c-K1685A和rB2c-K1829A两个突变毒株为主要研究对象。病毒体外生长曲线结果表明两个突变毒株的病毒滴度和在细胞中的扩散能力都要明显低于亲本毒株;在对小鼠的致病性实验中发现，无论是以后肢肌肉注射方式还是脑内注射方式进行感染，rB2c-K1685A和rB2c-K1829A都不能致成年小鼠发病;且其对乳鼠的致病性（体重变化、临床症状、死亡率）显著低于亲本毒株rB2c。
　　为了研究这些突变了K-D-K-E四聚体区域的重组病毒是否对病毒逃逸宿主先天性免疫方面也产生影响，我们将这些突变的重组病毒与亲本病毒在诱导Ⅰ型干扰素（interferon, IFN）的产生及对其敏感性方面进行了比较，结果表明与亲本病毒相比，rB2c-K1685A和rB2c-K1829A对Ⅰ型IFN敏感性增加，但其在感染RAW264.7细胞后并未诱导更多的Ⅰ型IFN的产生。研究表明IFIT1/2等干扰素刺激因子(interferon stimulated gene，ISG)可以对一些2'-O MTase缺陷的病毒复制产生影响，为了研究突变的rRABV是否也受这些ISG的影响，我们分别构建了过表达IFIT1和IFIT2的细胞系，用重组病毒感染这些细胞，结果表明过表达IFIT1并不能明显抑制重组病毒的复制，而过表达IFIT2则能显著抑制重组病毒的复制。
　　为了进一步研究K-D-K-E四聚体区域的突变是否对病毒的免疫原性产生影响，我们将重组病毒和亲本病毒分别免疫小鼠，并于免疫后第2周进行病毒中和抗体(VNA)滴度的测定，发现重组病毒和亲本病毒诱导产生的VNA均值都在10 IU/ml，在免疫后第3周用CVS-24进行攻毒实验，重组病毒rB2c-K1829A可以达到90％的保护率，而rB2c-K1685A和亲本病毒都能达到100％的免疫保护率。以上结果表明K-D-K-E四聚体区域的突变对病毒的免疫原性未有显著影响。
　　综上所述，K-D-K-E四聚体区域的突变对可以显著降低RABV的致病性，使其对Ⅰ型IFN以及IFIT2更为敏感，但并未显著影响病毒的免疫原性。该研究将对进一步理解L蛋白的K-D-K-E四聚体区域在RABV的致病性和逃逸宿主先天性免疫方面的作用机制奠定基础，同时也为RABV弱毒疫苗的研发提供了新的思路。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略语表

第一章 前言

1．1 狂犬病的危害和流行

1．2 RABV的分子生物学特征

1．2．1 RABV理化特性

1．2．2 RABV基因组结构特征

1．2．3 RABV的结构蛋白

1．3 RABV的复制

1．3．1 RABV的吸附和胞吞

1．3．2 RABV基因组的转录和复制

1．3．3 RABV的装配和出芽

1．4 狂犬病的防制及疫苗研发

1．4．1 狂犬病的治疗和预防

1．4．2 狂犬病疫苗的研发

1．5 mRNA 5’端帽子结构及其作用

1．5．1 mRNA 5’端帽子结构的存在能使pie-mRNA获得有效剪切

1．5．2 mRNA 5’端帽子结构能防止RNA从5’端降解

1．5．3 mRNA 5’端帽子结构利于起始蛋白翻译

1．5．4 病毒RNA 5’端帽子结构可以逃避宿主先天性免疫系统的围捕

1．6 宿主mRNA 5’端加帽的机制

1．7 病毒mRNA 5’端加帽的机制

1．7．1 经典加帽方式

1．7．2 非经典加帽方式

1．8 病毒mRNA 5’端加帽与逃避宿主先天性免疫之间的关系

第二章 研究目的和意义

第三章 材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 细胞

3．1．2 质粒和病毒

3．1．3 试剂和抗体

3．1．4 实验动物

3．1．5 实验仪器

3．2 方法

3．2．1 rRABV MTase潜在关键位点的预测

3．2．2 MTase潜在关键位点突变的rRABV全长克隆构建

3．2．3 rRABV的拯救

3．2．4 rRABV的传代

3．2．5 rRABV遗传稳定性的检测

3．2．6 rRABV的生长动力学

3．2．7 rRABV在BSR细胞中的荧光灶大小测定

3．2．8 Western blot

3．2．9 实时荧光定量RT-PCR

3．2．10 免疫组织化学检测

3．2．11 IFN预处理实验

3．2．12 Ⅰ型IFN的生物学检测实验

3．2．13 流式细胞术

3．2．14 RABVVNA的检测

3．2．15 rB2c对小鼠的致病力实验

3．2．16 K1685和K1829突变的rRABVs对小鼠的致病力实验

3．2．17 突变病毒rB2c-K1685A和rB2c-K1829A与亲本病毒rB2c的免疫原性比较

3．2．18 狂犬病发病小励瞄床症状评分标准

3．2．19 数据分析

第四章 结果和分析

4．1 RABVL基因中保守的K-D-K-E四聚体区域的确定以及MTase缺陷的突变体的构建

4．2 K-D-K-E结构域中的Asp-1797和Glu-1867影响重组病毒的遗传稳定性

4．3 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A的体外表型特征

4．4 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A未增加Ⅰ型IFN的产生

4．5 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A比rB2c对IFN预处理反应更国圜

4．6 IFIT2可以在体外限制rB2c-K1685A和rB2c-K1829A的复制

4．7 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A在体内的致病力减弱

4．7．1 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A不能通过后肢肌肉注射的方式使小鼠产生狂犬病症状

4．7．2 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A不能通过脑内注射的方式使小鼠产生狂犬病症状

4．8 rB2c-K1685A和rB2c-K1829A的免疫原性与rB2c相当

第五章 讨论

5．1 关于MTase活性鉴定的方法和可行性

5．2 K-D-K-E催化四聚体区域承担MTase活性

5．3 IFITs对MTase功能缺失病毒的作用机制分析

5．4 制备MTase缺失的弱毒疫苗株的可行性

5．4．1 MTase缺陷病毒的遗传稳定性

5．4．2 MTase缺陷病毒的免疫原性

5．4．3 MTase缺陷病毒的作为疫苗株的改进

结论

参考文献

个人资料

教育背景

已发表论文

致谢