大豆早期共生信号传导途径基因的克隆及功能验证

摘要

大豆是世界上最主要的经济作物和最重要的油料作物之一。豆科植物与根瘤菌形成的共生固氮系统是自然界最重要的固氮方式，共生固氮因其高效性和经济性而在农业生产中具有举足轻重的作用。目前国内外关于豆科植物与根瘤菌共生固氮的研究大多集中于模式植物，很多早期结瘤基因已被鉴定，但对于大豆与根瘤菌共生结瘤固氮的研究较少。本研究通过对大豆早期结瘤基因SymRK、CCaMK、NSP1、NSP2、NIN进行功能鉴定，期望对大豆-根瘤菌共生结瘤信号传导过程进行探索。主要研究结果如下:
　　1.为了鉴定基因GmSymRKα/β、GmCCaMKα/β、GmNSP1α/β、GmNSP2α及GmNINα在大豆-根瘤菌共生结瘤过程中的功能，我们利用毛根转化技术，验证了其过量表达和下调表达对大豆植株结瘤数的影响。结果表明:GmSymRKα/β、GmCCaMKα/β、GmNSP1α/β、GmNSP2α、GmNINα过量表达后，植株结瘤数显著多于对照组;GmSymRKα/β、GmCCaMKα/β基因下调表达后，植株结瘤数显著少于对照组。以上结果表明GmSymRKα/β、GmCCaMKα/β、GmNSP1α/β、GmNSP2α、GmNINα在大豆结瘤过程中均具有重要作用。
　　2.我们利用毛根转化技术，验证了在蒺藜苜蓿突变体mtdmi3、mtnsp1-1及野生型A17中基因互补和过量表达对植株结瘤数的影响。结果表明:在mtdmi3中表达GmCCaMKβ能够使植株恢复结瘤能力;在mtnsp1-1中表达GmNSP1α/β均能够使植株恢复结瘤能力;同时，在野生型蒺藜苜蓿A17中过量表达GmCCaMKβ、GmNSP1α/β均能显著增加植株结瘤数目。以上结果说明，GmCCaMKβ在蒺藜苜蓿中能够互补DMI3的生物学功能;GmNSP1α/β在蒺藜苜蓿中均能互补NSP1的生物学功能。
　　3.利用qRT-PCR检测了各基因表达情况的相互影响，结果表明:过量表达基因GmSymRK使GmCCaMK、GmNSP1及GmNSP2的表达受到不同程度的上调，抑制GmSymRK的表达使GmCCaMK、GmNSP1及GmNSP2的表达受到不同程度的下调;过量表达基因GmCCaMK使GmNSP1、GmNSP2的表达受到不同程度的上调，抑制GmCCaMK的表达使GmNSP1、GmNSP2的表达受到不同程度的下调;过量表达GmNSP1使GmNSP2及GmNIN的表达受到强烈上调;过量表达GmNSP2α使GmCCaMK、GmNIN的表达受到不同程度的下调;过量表达GmNINα使GmNSP2的表达受到强烈下调。以上结果说明，在早期结瘤信号传导途径中GmSymRK位于 GmCCaMK上游，GmNSP1、GmNSP2及GmNIN位于GmCCaMK下游;GmNSP2α对GmCCaMK可能存在负反馈调节;GmNINα对GmNSP2也可能存在负反馈调节。故大豆-根瘤菌早期共生结瘤信号传导途径与豆科模式植物相似。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 共生固氮的意义

1．2 根瘤的形成过程

1．3 根瘤菌结瘤因子与豆科植物受体的识别

1．3．1 根瘤菌结瘤因子的合成

1．3．2 结瘤因子与豆科植物受体的识别

1．4 结瘤信号传导途径中的功能基因

1．4．1 共生受体激酶及其互作蛋白

1．4．2 离子通道蛋白和核孔蛋白

1．4．3 依赖于钙和钙调素的蛋白激酶及其互作蛋白

1．4．4 NSP转录因子及其互作蛋白

1．4．5 结瘤起始蛋白NIN及其互作蛋白

1．5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体与菌株

2．1．3 分子生物学试剂

2．1．4 培养基

2．2 方法

2．2．1 植物材料总RNA提取

2．2．2 cDNA第一链的合成

2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)及转化

2．2．4 农杆菌电转化感受态细胞的制备及转化

2．2．5 目的基因序列查找及引物设计

2．2．6 目的基因的克隆

2．2．7 载体的构建

2．2．8 大豆毛根转化

2．2．9 蒺藜苜蓿毛根转化

3 结果与分析

3．1 目的基因序列分析

3．1．1 GmSymRK基因序列分析

3．1．2 GmCCaMK基因序列分析

3．1．3 GmNSP1基因序列分析

3．1．4 GmNSP2基因序列分析

3．1．4 GmNIN基因序列分析

3．2 目的基因的克隆

3．2．1 大豆根瘤总RNA提取

3．2．2 目的片段的扩增

3．2．3 载体的构建

3．3 目的基因的功能验证

3．3．1 GmSymRK的功能验证

3．3．2 GmCCaMK的功能验证

3．3．3 GmNSP1的功能验证

3．3．4 GmNSP2α和GmNINα的功能验证

3．4 GmSymRK、GmCCaMK、GmNSP1、GmNSP2及GmNIN的相互影响

3．4．1 GmSymRK对GmCCaMK、GmNSP1、GmNSP2表达的影响

3．4．2 GmCCaMK对GmNSP1、GmNSP2表达的影响

3．4．3 GmNSP1对GmCCaMK、GmNSP2、GmNIN表达的影响

3．4．4 GmNSP2α对GmCCaMK、GmNSP1、GmNIN表达的影响

3．4．5 GmNINα对GmNSP1、GmNSP2表达的影响

4 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

参考文献

附录

致谢