TLR4信号通路在脂多糖或鼠伤寒沙门氏菌诱导的雏鸡肝损伤中的作用

摘要

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为天然免疫中最为重要的一类模式识别受体，能够特异性地识别病原微生物的保守结构——病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），从而激活下游信号通路，调节机体的免疫应答。其中，TLR4广泛表达于肝脏实质及非实质细胞中，通过识别革兰氏阴性菌细胞壁的主要构成分子脂多糖（lipopo lysaccharide，LPS），对肝脏生理状态的维持和病理过程的发展都起着至关重要的作用。有研究证实，LPS/TLR4信号通路参与了多种肝脏疾病的发生与发展。然而，目前关于TLR4信号通路与肝损伤关系的研究大都集中在哺乳动物上，且关于肝损伤后TLR4信号通路相关分子的动态变化鲜有报道。为此，本研究拟以1日龄科宝肉鸡为研究对象，采用HE染色、变色酸2R染色、免疫组织化学染色和Q-PCR等方法研究LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏组织结构、炎症因子表达以及肝细胞凋亡的动态变化，同时检测TLR4信号通路相关分子的表达变化，为阐明TLR4信号通路与雏鸡肝损伤之间的关系奠定分子基础。主要的研究内容和结果如下:
　　1.LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝脏组织结构和ALT活性的影响
　　为了研究LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏组织结构和谷丙转氨酶（alaninetransaminase，ALT）活性的变化，本试验采用LPS或鼠伤寒沙门氏菌腹腔注射1日龄科宝肉鸡。结果显示:腹腔注射LPS6h、12h和24 h后，肝脏出现了严重的脂肪变性，肝窦中异嗜性粒细胞的数量显著增多，注射后72 h和120 h时，主要表现为广泛的炎性细胞浸润。鼠伤寒沙门氏菌刺激后，与同时间点对照组相比，肝窦中异嗜性粒细胞数量均显著增多，但刺激后2 h和6h时未见明显的病理变化，24 h和36 h时主要表现为脂肪变性，气球样变和淤血，72 h时门管区出现少量的炎性细胞浸润。LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后ALT活性与对照组相比均显著升高，且随着时间的延长呈现先升高后恢复的趋势，其中LPS刺激后12h达到峰值，鼠伤寒沙门氏菌刺激后24 h达到峰值。以上结果说明，LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激可诱导雏鸡肝脏的急性损伤。
　　2.LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝脏炎性因子表达的影响
　　为了研究LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏内炎性因子的表达变化，本研究采用Q-PCR检测了促炎因子TNF-α和IL-1β及抗炎因子TGF-β的表达变化。结果显示:LPS刺激后TNF-α、IL-1β和TGF-β的表达均呈现先升高后恢复的趋势，刺激后2h时呈现爆发式增长，6 h时开始下降，但是始终高于对照组的表达水平。与TNF-α和IL-1β相比，TGF-β的增长幅度较低。鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏炎性因子的表达同样是表现为先升高后恢复的趋势，抗炎因子和促炎因子表达都在24 h达到峰值，虽然同样高于对照组的表达水平，但是不如LPS刺激之后的变化剧烈。以上结果显示，LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激能够导致肝脏抗炎因子和促炎因子的表达失衡，进而导致肝损伤。此外，鼠伤寒沙门氏菌刺激对炎性因子表达的影响比LPS要弱，这与肝脏组织结构变化的结果相符。
　　3.LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝细胞凋亡和增殖的影响
　　为了研究LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝细胞凋亡和增殖的影响，本研究采用免疫组织化学染色技术研究了ssDNA和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclearantigen, PCNA）在肝脏中的表达变化;采用caspase-3活性检测试剂盒，检测了肝脏caspase-3的活性变化;采用Q-PCR检测了肝脏caspase-3、caspase-8和PCNA的表达变化。结果显示:LPS刺激导致的细胞凋亡主要集中在刺激后的2h、6 h和12 h，刺激后24 h时细胞凋亡被明显抑制，这与caspase-3活性检测结果一致:LPS刺激后肝脏caspase-3活性呈现先升高后降低的趋势，12 h时达到峰值，2h、6h和12 h时高于对照组的caspase-3活性，达到极显著水平，24 h时caspase-3活性则显著低于对照组。Caspase-3和caspase-8mRNA表达水平在LPS刺激后2 h达到峰值，6h时开始下降，12h时显著低于对照组表达水平。鼠伤寒沙门氏菌刺激后caspase-3和caspase-8 mRNA表达在24 h达到峰值，但是鼠伤寒沙门氏菌刺激后未见caspase-3活性的显著升高，且在12 h和24 h时caspase-3活性显著低于对照组。LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后PCNA表达均显著降低，72 h和120 h时PCNA的表达则缓慢升高并接近对照组表达水平。以上结果说明:LPS刺激能够通过促进肝细胞凋亡，并抑制肝细胞增殖导致肝损伤，且肝细胞凋亡主要是通过活化的caspase-3介导;鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝细胞凋亡处于抑制状态，主要是通过抑制肝细胞的增殖导致肝损伤的发生。
　　4.LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对TLR4信号通路相关分子表达的影响
　　为了研究LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对TLR4信号通路相关分子表达的影响，采用免疫组织化学染色技术检测肝脏TLR4表达的变化规律;通过Q-PCR检测TLR4及其信号通路下游分子核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88，MyD88)的表达变化。结果显示:LPS刺激后TLR4的表达呈现波浪形变化，刺激后6h时TLR4表达呈现爆发式增长，之后则呈现先降低后升高的趋势，24 h和36 h时低于对照组的表达水平，72 h和120 h时则显著高于对照组。鼠伤寒沙门氏菌刺激后TLR4的表达大体呈现先升高后降低的趋势，24 h时达到峰值，36 h时开始降低，120 h时低于对照组的表达水平。LPS刺激后NF-κB的表达均高于对照组，刺激后2h达到峰值。鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏NF-κB表达在24 h达到峰值，120 h时下降到低于对照组的水平。LPS刺激后2h肝脏MyD88表达呈现爆发式增长，6h时开始下降，36h时显著低于对照组。鼠伤寒沙门氏菌刺激后MyD88表达在24 h时达到峰值，36h时开始降低，120 h时显著低于对照组的表达水平。以上结果说明，LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激能够通过激活TLR4信号通路诱导肝脏炎性因子表达和肝细胞凋亡导致肝损伤的发生。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 肝脏的免疫功能

1．2．2 TLR4信号通路简介

1．3 选题目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验动物与器材

2．1．1 试验动物及处理

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液和试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 样品采集与处理

2．2．2 石蜡切片制作

2．2．3 苏木精-伊红(HE)染色

2．2．4 变色酸2R染色

2．2．5 免疫组织化学染色

2．2．6 细胞凋亡检测

2．2．7 谷丙转氨酶活性检测

2．2．8 caspase-3活性检测

2．2．9 BCA法测定组织匀浆液的蛋白浓度

2．2．10 荧光定量PCR

2．2．11 数据统计分析

3 结果

3．1 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝脏组织结构的影响

3．2 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏ALT活性的变化

3．3 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏炎性因子的表达变化

3．4 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝细胞凋亡的影响

3．4．1 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏caspase-3活性变化

3．4．2 LPS刺激对肝细胞凋亡的影响

3．4．3 LPS刺激或鼠伤寒沙门刺激后肝脏caspase-3 caspase-8的表达变化

3．5 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝细胞增殖的影响

3．6 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏TLR4信号通路相关分子的表达变化

4 讨论

4．1 LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激对肝脏组织结构及ALT活性的影响

4．2 TLR4信号通路对LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝脏炎性因子表达的影响

4．3 TLR4信号通路对LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝细胞凋亡的影响

4．4 TLR4信号通路对LPS或鼠伤寒沙门氏菌刺激后肝细胞增殖的影响

5 结论

6 本研究的创新之处

7 本研究的不足之处

参考文献

致谢

附录1 个人简历

附录2 论文发表情况