PRRSV遗传变异分析及其nsp2蛋白的定量相互作用组学研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要以妊娠母猪发生明显的繁殖障碍以及仔猪出现严重的呼吸系统疾病和生长迟缓为主要特征，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起一种严重危害全球养猪业的病毒性传染病。尤其是2006年由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引发的猪“高热病”给我国养猪业造成了沉重的打击。之后，2009年、2011年和2015年PRRS在我国都出现不同程度的暴发。此外，2015年来自美国的NADC30-like毒株在我国不同省份引发母猪严重的流产或早产。因此，非常有必要对我国PRRSV流行病学、基因变异和同源重组等情况进行跟踪调查，并掌握PRRSV的遗传变异规律，为PRRSV的防控提供理论基础。
　　PRRSV nsp2蛋白作为PRRSV最大的非结构蛋白，也是PRRSV基因组中突变率最高的蛋白之一，可以通过对nsp2基因的监控，以达到了解PRRSV的遗传演化和变异规律的目的，更重要的是，nsp2能够在病毒复制和免疫调控方面都发挥着非常重要的作用，因此，本研究利用定量相互作用组学的方法对与nsp2相互作用的其他病毒蛋白和宿主蛋白进行LC-MS/MS鉴定。主要研究内容包括:
　　1.PRRSV流行病学调查及新毒株的分离鉴定
　　2010年至2015年间在我国东南17省收集了1909份临床样品，对其进行流行病学调查，其中PRRSV经典株的阳性率仅为3.87％，而HP-PRRSV毒株的阳性率高达43.48％，且呈逐年下降趋势。发现我国PRRSV的流行趋势逐渐从以HP-PRRSV毒株的流行为主，变为以NADC30-like毒株的流行为主，并且有两种毒株共感染的情况存在。同时发现猪的粪便样品中也能检测到PRRSV，阳性率可达43.97％，并从中分离到一株HP-PRRSV: WUH4株，推测PRRSV可以通过粪-口途径传播这一新方式。此外，2014年以后在临床上检测到了PRRSV NADC30-like毒株的流行，阳性率高达63.04％。在PRRSV NADC30-like阳性样品中，成功地分离到PRRSVWUH5和WUH6两株毒株。全基因组及各个蛋白序列比对分析，发现WUH5和WUH6株在nsp2的HV区域都存在130个氨基酸的不连续缺失。通过同源重组进一步分析，发现WUH6株为重组毒株，并推测其亲本可能为NADC30和JXA1株，其中间重组区域与JXA1毒株高度同源，而两端区域与NADC30毒株有较高的相似度。
　　2.PRRSV nsp2定量相互作用组学研究
　　利用SILAC结合IP实验的定量相互作用组学技术，在PRRSV感染的条件下对与nsp2蛋白相互作用的蛋白进行串联质谱(LC-MS/MS)分析，鉴定出9个病毒蛋白和62个宿主蛋白能够与nsp2发生特异性互作，并利用IPA软件对与nsp2互作的62个宿主蛋白进行相互作用网络分析，进而生成了nsp2互作网络图。
　　在PRRSV感染和超表达条件下对病毒蛋白与nsp2之间的相互作用进行了验证，实验证实nsp2能够与nsp1α、nsp1β和N发生相互作用，而nsp2与GP5只在病毒感染条件下有间接的相互作用。同时，在PRRSV感染和超表达条件下对宿主蛋白与nsp2之间的相互作用进行了验证，实验证实nsp2能够与YWHAB、YWHAZ和MARK2分别发生相互作用，而nsp2与vimentin只在病毒感染条件下有间接的相互作用。但是，有趣的是，通过实验Co-IP实验证实了作为PRRSV受体之一的vimentin能够与nsp2和N蛋白能够形成一个蛋白复合体，其中N蛋白起着桥梁的作用。在N蛋白的存在下，nsp2与vimentin蛋白能够相互地发生相互作用，而N蛋白不存在的条件下，nsp2与vimentin蛋白之间没有相互作用。此外，通过RNA干扰实验证实干扰宿主蛋白YWHAB、YWHAZ、MARK2或vimentin能够显著地降低PRRSV在Marc-145细胞中的复制。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 猪繁殖与呼吸综合征

1．1．1 PRRS的流行病学

1．1．3 PRRSV的病原特性

1．1．4 PRRSV的分子生物学研究

1．1．5 PRRS的免疫学反应

1．1．6 PRRS的疫苗研究

1．2 PRRSV nsp2的结构与功能

1．2．1 PRRSV nsp2的结构

1．2．2 PRRSV nsp2的功能

1．3 蛋白质组学研究技术

1．3．1 蛋白质组学在病毒学中的应用

1．3．2 蛋白质组学在病毒蛋白与宿主蛋白相互作用方面的应用

1．3．3 稳定同位素标记氨基酸技术(SILAC)

第2章 PRRSV流行病学调查和遗传变异分析

2．1 研究目的与意义

2．2 实验材料

2．2．1 病料、细胞、毒株、菌株和载体

2．2．2 工具酶及主要试剂

2．2．3 抗体及Western blot所需实验材料

2．2．4 培养基与抗生素及其配制

2．2．5 主要缓冲液与相关试剂及其配制

2．2．6 主要实验仪器及设备

2．2．7 分子生物学分析软件

2．3 实验方法

2．3．1 病料采集与处理

2．3．2 病毒的分离

2．3．3 PRRSV的增殖

2．3．4 总RNA的提取

2．3．5 两步法RT-PCR

2．3．6 PCR产物或酶切产物回收与纯化

2．3．7 外源DNA片段与载体的连接反应

2．3．8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

2．3．9 连接产物的转化

2．3．10 质粒的制备与鉴定

2．3．11 重组质粒(阳性质粒)的鉴定

2．3．12 PRRSV GP5序列和全基因组序列的测定

2．3．13 分离病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定

2．3．14 病毒空斑实验对病毒的分离纯化

2．3．15 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定

2．3．16 绝对荧光定量检测PRRSV病毒载量

2．3．17 Western blot检测病毒蛋白

2．4 结果与分析

2．4．1 2010年到2015年PRRSV流行状况分析

2．4．2 PRRSV ORF5基因序列分析

2．4．3 PRRSV WUH4毒株的全基因组序列分析

2．4．4 PRRSV WUH5和WUH6毒株的全基因组序列分析

2．4．5 重组毒株PRRSV WUH6的病毒增殖滴度测定

2．5 讨论

2．5．1 PRRSV新毒株的分离

2．5．2 PRRSV nsp2蛋白的变异分析

2．5．3 PRRSV GP5蛋白的变异分析

2．5．4 PRRSV重组分析

第3章 PRRSV nsp2蛋白与宿主蛋白相互作用组学研究

3．1 研究目的与意义

3．2 实验材料

3．2．1 细胞、毒株

3．2．2 载体与质粒

3．2．3 抗体及主要试剂

3．2．4 免疫沉淀(IP)、Co-IP及抗体交联实验所需材料

3．2．5 培养基及其配置

3．2．6 主要缓冲液与相关试剂及其配置

3．2．7 主要实验仪器及设备

3．2．8 分子生物学信息软件

3．3 实验方法

3．3．1 IFA和Western blot实验检测PRRSV nsp2蛋白表达水平

3．3．2 稳定同位素标记及用于IP实验的细胞样品制备

3．3．3 BCA法测定蛋白浓度

3．3．4 IP实验

3．3．5 SDS-PAGE蛋白胶银染

3．3．6 LC-MS／MS鉴定

3．3．7 生物信息学分析

3．3．8 质粒及siRNA的转染(脂质体介导转染法)

3．3．9 IP和Co-IP实验对PRRSV nsp2与宿主蛋白互作的验证

3．3．10 PRRSV nsp2与宿主蛋白共定位观察

3．3．11 干扰宿主蛋白后PRRSV滴度的测定

3．3．12 统计学方法

3．4 结果与分析

3．4．1 用于nsp2相互作用组学的PRRSV感染时间点的确定

3．4．2 细胞标记测试结果

3．4．3 用于IP实验的全细胞裂解液蛋白浓度的测定

3．4．4 PRRSV nsp2互作蛋白鉴定的IP实验

3．4．5 PRRSV nsp2互作蛋白的质谱鉴定

3．4．6 PRRSV nsp2与其他病毒蛋白互作的验证

3．4．7 PRRSV nsp2互作蛋白的生物信息学分析

3．4．8 PRRSV nsp2与宿主蛋白互作的验证

3．4．9 PRRSV nsp2、N和vimentin蛋白复合物的验证

3．4．10 PRRSV nsp2互作宿主蛋白对PRRSV复制的影响

3．4．11 其他宿主蛋白的验证

3．5 讨论

3．5．1 本实验方案的优势

3．5．2 PRRSV nsp2与其他病毒蛋白的互作

3．5．3 PRRSV nsp2与宿主蛋白的互作

3．5．4 PRRSV nsp2功能的探讨

第4章 结论

参考文献

附表

致谢

个人资料

教育经历

成果转化情况

在读期间发表的主要文章