PRRSV流行毒株NSP2、PRF5遗传变异分析及其弱毒疫苗免疫效果评价

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，2006～2007年，中国南部暴发以死亡率高、传播速度快为特征的高致病性PRRSV（HP-PRRSV），给广大养殖户带来巨大经济冲击。
　　为了解我国PRRSV流行情况和不同免疫背景下发病猪群相关毒株遗传进化和变异特点，本研究对我国不同地点和时间发病猪的病料进行PRRSV流行病学检测、病毒分离。
　　目前，疫苗免疫是预防和控制HP-PRRS的重要措施，虽然商品化弱毒疫苗较灭活苗可以更快诱发机体的特异性免疫，但在临床使用中弱毒疫苗的免疫时间、免疫剂量及免疫次数等方面经常出现使用混乱的现象，而且对其免疫效果仍缺乏较完善的评价体系，因此本研究对市场常用的两种商品化PRRS活疫苗JXA1-R和CH-1R进行了免疫效果评价。研究内容如下:
　　1.PRRSV流行毒株的分离及遗传变异分析
　　2012～2013年，本研究在湖北、湖南、广东、河南等地采集临床样品720份，PRRSV检测总阳性率为49.3％，分离得到46株遗传免疫背景清楚的样品，并对其部分NSP2基因、ORF5基因进行序列测定，比对显示46株PRRSV之间部分NSP2氨基酸同源性为83.8％～100％，NSP2蛋白普遍存在不连续30个氨基酸缺失，缺失位置与高致病性JXA1相同，同时46株PRRSV之间ORF5氨基酸同源性为91.0％～100％，与VR-2332相比，GP5序列出现多处突变，尤其是抗原表位序列，此外，N糖基化位点的位置和数量也发生了改变，对46株PRRSV的GP5TM区预测发现有33株序列存在氨基酸变异较高的TM1区。
　　2.HZ-31全基因组序列分析
　　分离得到一株新的PRRSV，命名为HZ-31，测序分析发现HZ-31的NSP2基因在471-500aa、533-561aa位点共缺失59个氨基酸，并且其基因组两端非编码区各存在一个碱基的缺失，是一种新的变异株。
　　3.对JXA1-R活疫苗和CH-1R活疫苗进行免疫效果评价
　　PRRS活疫苗可快速刺激机体产生体液免疫，JXA1-R活疫苗比CH-1R活疫苗的ELISA抗体转阳时间更早，水平更高，同时中和抗体出现时间更早，水平更高，在抵御强毒攻毒时，JXA1-R诱导宿主产生的中和抗体可中和血清中的PRRSV，与病毒血症的消除呈正相关。两种活疫苗在免疫和攻毒期间均未检测出高水平的IFN-γ。两种活疫苗在免疫期间均检测到病毒血症的存在，攻毒后JXA1-R组病毒血症迅速消失，CH-1R组的病毒血症持续存在。JXA1-R组和CH-1R组攻毒后均无鼻腔排毒，对照组轻微排毒，JXA1-R组攻毒后粪拭子无排毒，CH-1R组和对照组在攻毒后第10d均有排毒。剖检可见JXA1-R组病变轻微，CH-1R组个别猪只肺部有出血点，肺门淋巴结充血，对照组肺部肉样实变，肺门淋巴结严重充血、出血，个别猪只肾有出血点。JXA1-R组和CH-1R组在肺、脾、肾、脑的病毒载量与对照组差异显著。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 PRRSV概况

1．2 PRRSV病原学特性

1．2．1 PRRSV分类

1．2．2 抗原性

1．2．3 临床特性

1．2．4 生物学特性

1．3 分子生物学研究进展

1．3．1 PRRSV基因组结构

1．3．2 PRRSV非结构蛋白质

1．3．3 PRRSV结构蛋白质

1．3．4 PRRSV基因遗传变异和抗原性变异

1．3．5 PRRSV毒力变异

1．4 PRRSV的免疫学研究进展

1．4．1 体液免疫

1．4．2 细胞免疫

1．5 PRRS诊断方法研究进展

1．5．1 血清学诊断方法

1．5．2 分子生物学诊断方法

1．6 PRRS疫苗研究进展

1．6．1 PRRS常规疫苗

1．6．2 PRRS新型疫苗

2 研究目的和意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 毒株和细胞

3．1．2 病料、疫苗和实验动物

3．1．3 工具酶和主要试剂

3．1．4 相关试剂及其配制

3．1．5 引物设计与合成

3．1．6 分子生物学软件

3．2 实验方法

3．2．1 病料采集与处理

3．2．2 血清或组织样品总RNA的提取

3．2．3 两步法RT-PCR

3．2．4 PCR产物或酶切产物的回收与纯化

3．2．5 回收后DNA片段与质粒载体的连接反应

3．2．6 连接产物的转化

3．2．7 质粒的小量提取

3．2．8 重组质粒的酶切鉴定

3．2．9 测序

3．2．10 动物实验

3．2．11 PRRSV WUH3的增殖

3．2．12 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定

3．2．13 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)

3．2．14 IFN-γ的检测

3．2．15 PRRSV抗体检测

3．2．16 绝对荧光定量检测病毒血症及病毒载量

3．2．17 病理切片制作

3．2．18 统计学方法

4 结果与分析

4．1 PRRSV遗传变异分析

4．1．1 PRRSV流行毒株检测与分离

4．1．2 HZ-31的检测与分离

4．1．3 流行毒株NSP2序列分析

4．1．4 流行毒株ORF5序列分析

4．2 PRRSV HZ-31序列分析

4．2．1 PRRSV HZ-31全基因组分段RT-PCR扩增结果

4．2．2 PRRSV HZ-31全基因组序列分析

4．2．3 PRRSV HZ-31序列分析

4．2．4 HZ-31株毒力相关氨基酸的变异分析

4．3 PRRS弱毒疫苗的免疫效果评价

4．3．1 临床症状观察

4．3．2 血清中PRRSV ELISA抗体水平

4．3．3 血清中PRRSV中和抗体水平

4．3．4 血清中IFN-γ水平

4．3．5 病毒血症

4．3．6 鼻拭子、粪拭子排毒情况

4．3．7 剖检、病理观察

4．3．8 组织病毒载量

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．1．1 NSP2蛋白的变异分析

5．1．2 ORF5蛋白的变异分析

5．1．3 HZ-31全基因组序列分析

5．1．4 PRRS活疫苗免疫效果评价

5．2 结论

参考文献

致谢