厉眼蕈蚊传播核盘菌弱致病性相关DNA病毒1研究

摘要

真菌病毒(Mycovirus或Fungal virus)是指侵染真菌并在寄主真菌细胞中复制的病毒。部分真菌病毒侵染植物病原真菌后导致寄主致病力减弱，这类病毒是潜在的植物真菌病害生物防治资源。前人研究表明真菌病毒依赖寄主的有性和/或者无性孢子进行垂直传播，或者通过寄主菌丝体融合进行水平传播。目前并没有关于真菌病毒传播介体的报道。
　　厉眼蕈蚊（Lycoriella ingenua）是一种常见的噬真菌昆虫，其成虫体型细小(1.8-3.2 mm)，常钻入培养皿中产卵于真菌菌落上，卵孵化后幼虫取食真菌菌丝。厉眼蕈蚊食谱广泛，也可以取食核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在培养核盘菌时发现感染了核盘菌弱致病性相关DNA病毒1（Sclerotinia sclerotiorumhypovirulence-associated DNA virus1，SsHADV-1）的核盘菌菌株比未感染病毒的菌株对厉眼蕈蚊具有更强的吸引力。推定厉眼草蚊与SsHADV-1之间存在特定的互作关系。为了验证厉眼蕈蚊与SsHADV-1之间是否存在相互作用，采用感染SsHADV-1的核盘菌菌株DT-8饲养厉眼蕈蚊，然后检测厉眼蕈蚊是否能够从菌株DT-8获得SsHADV-1并将病毒传播给不携带病毒的核盘菌菌株、研究厉眼蕈蚊与SsHADV-1之间可能存在的互作关系。本研究获得的主要结果如下:
　　挑取饲养于菌株DT-8菌落上的厉眼蕈蚊幼虫用无菌ddH2O清洗3遍后提取DNA进行PCR检测，可以检测到病毒的DNA，表明幼虫体内或体表携带了SsHADV-1。幼虫取食菌株DT-8后即使饥饿处理7天，仍然可以检测到病毒。之后进一步研究发现，在厉眼蕈蚊的蛹、成虫和卵中也可以通过PCR扩增和Southern blot杂交两种方法检测到SsHADV-1的DNA。采用免疫荧光观察证明病毒存在于厉眼蕈蚊幼虫、蛹、成虫的中肠和输卵管及卵等部位。幼虫取食携带SsHADV-1的核盘菌时，仅取食0.5 hr就可以快速获得病毒。将菌株DT-8菌落上饲养的幼虫及病毒粒子注射的幼虫饲养于SsHADV-1的非寄主灰葡萄孢B05.10菌落上，经化蛹、羽化、交配、产卵并孵化后，后代幼虫也可以检测到病毒存在，且检出率到达80％以上，表明该病毒可以经卵传播。
　　采用RT-PCR检测发现SsHADV-1的Rep和CP在厉眼草蚊体内表达，推定SsHADV-1可能可以在昆虫体内复制。为了证明该病毒是否可以在昆虫细胞内复制，用纯化的SsHADV-1病毒粒子接种草地螟夜蛾细胞系(Spodopterafrugiperda cells)Sf9细胞，通过RT-PCR扩增和Northern blot杂交可以检测到SsHADV-1的Rep和CP在病毒接种的Sf9细胞中表达，免疫荧光检测也可以在Sf9细胞中观察到SsHADV-1的荧光信号。qPCR检测显示病毒基因组DNA在Sf9细胞中可以大量地复制积累。对初始浓度为300 ng/μl的病毒粒子悬液进行梯度稀释后接种Sf9细胞，发现稀释1000倍后仍然可以感染Sf9细胞;采用流式细胞仪测定发现SsHADV-1(30ng/μl)接种Sf9细胞24 hr后细胞感染率可以达到60％左右。继代培养病毒侵染的Sf9细胞试验发现病毒可以从侵染的Sf9细胞中释放出来感染新的Sf9细胞。感染病毒的细胞培养液的上清液也可以直接侵染不携带病毒的核盘菌，并导致核盘菌出现类似菌株DT-8的特性。
　　为了明确携带病毒的厉眼蕈蚊是否可以将病毒传播给不携带病毒的核盘菌菌株，将菌株DT-8菌落上饲养的幼虫用无菌水冲洗3次后移至菌株DT-8VF（不携带病毒）的菌落上继续取食，从幼虫取食的虫道上挑取菌丝块移至新的PDA平板上培养，获得继代培养菌株，采用PCR扩增逐个检测39个菌丝块形成的菌落，检出率达到20.5％，滚环复制扩增-Southern blot杂交进一步证实PCR检测阳性的菌株携带SsHADV-1。获得病毒的菌株表现出显著的致病力衰退及其它相关表型，但其衰退程度不及菌株DT-8，病毒DNA的含量也较低，不能直接通过电泳检测到。幼虫在菌株DT-8VF菌落上取食0.5 hr即可成功传播病毒。进一步研究发现携带SsHADV-1的厉眼蕈蚊卵、幼虫、蛹和成虫均可以传播该病毒。室内模拟油菜田传毒试验显示厉眼蕈蚊成虫在发病的油菜上也可以传播SsHADV-1。为了排除厉眼蕈蚊携带感染病毒的菌丝碎片而传播病毒的可能性，用SsHADV-1病毒粒子悬液注射幼虫饥饿处理1天后取食不携带病毒的核盘菌，发现也可以将病毒传播给菌株DT-8VF。病毒粒子注射的蛹经羽化、交配和产卵后，将卵块转移至核盘菌菌落中，孵化出的幼虫取食核盘菌，也可以将病毒传染给菌株DT-8VF。
　　厉眼蕈蚊成虫趋向于携带SsHADV-1的核盘菌菌株产卵，进一步试验发现将活性炭放置在携带病毒菌株与不携带病毒菌株的菌落之间可以干扰厉眼蕈蚊成虫的选择趋向性。收集两种菌落释放的挥发性气体进行“Y”形管行为测定，发现昆虫对菌株DT-8释放的气体具有强烈的趋化行为，表明病毒可能促进或抑制了特定的挥发性物质的产生。收集这两个核盘菌菌株产生的挥发性物质，进行GC-MS分析，发现菌株DT-8和DT-8VF所释放的气体在组份上没有显著差异，但是菌株DT-8所释放的蘑菇醇和辛酮明显少于菌株DT-8VF。“Y”形管行为测定试验结果表明蘑菇醇和辛酮对厉眼草蚊雌成虫具有强烈的趋避作用。表明SsHADV-1侵染核盘菌后可以减少蘑菇醇和辛酮的产生，从而吸引厉眼蕈蚊成虫趋向于携带病毒的核盘菌菌株产卵。qRT-PCR测定也表明在菌株DT-8中合成蘑菇醇和辛酮相关的部分基因表达量显著降低。同时感染病毒的厉眼蕈蚊雌成虫怀卵量显著提高28.9％，表明SsHADV-1与厉眼蕈蚊之间可能存在互惠性的相互作用。
　　调查华中农业大学试验基地及湖北省咸宁市和鄂州市的油菜田，发现厉眼蕈蚊可以在自然发病的油菜田中生长发育和繁殖，幼虫偏向于在发病的油菜茎秆内部取食核盘菌菌丝并在其中化蛹，成虫在油菜叶片和花瓣上活动。在喷施菌株DT-8的油菜田和未喷施的油菜田均可以捕捉到厉眼蕈蚊成虫，并且可以从这些成虫中检测到SsHADV-1的DNA，在喷菌的油菜田检出率高达81.4％，而在未喷施的油菜田检出率为22.4％。表明携带SsHADV-1的厉眼蕈蚊在田间自然存在，田间喷施菌株DT-8可以提高携带病毒的厉眼蕈蚊的比率。此外，从自然发病的油菜田采集厉眼蕈蚊成虫，通过高通量测序分析发现这些成虫携带多种真菌病毒，厉眼蕈蚊可能也可以传播这些真菌病毒。
　　总之，本研究发现真菌病毒（SsHDAV-1）可以跨界感染昆虫（厉眼蕈蚊），在其体内进行复制并且可以利用该昆虫作为介体在寄主真菌中传播和扩散。这是首次报道真菌病毒可以跨界侵染昆虫并在昆虫细胞中复制，同时证明厉眼蕈蚊可以作为真菌病毒SsHDAV-1的传播介体且二者之间存在着互惠关系。该发现不仅对利用真菌病毒控制作物真菌病害研究具有显著的促进作用，还加深了我们对真菌病毒生态意义的理解，同时也丰富了病毒、寄主和传毒昆虫之间互作关系的研究，为研究真菌病毒、真菌与昆虫之间的互作关系提供了模型。另外，现有的研究表明SsHADV-1代表着一类新出现的环状小分子DNA病毒，本研究对解析与SsHADV-1类似病毒的生态意义提供了线索。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 真菌病毒研究进展

1．1 真菌病毒的发现

1．2 真菌病毒的分类

1．3 研究真菌病毒的意义

1．3．1 真菌病毒对生物防治的意义

1．3．2 真菌病毒对病毒进化的意义

1．3．3 真菌病毒对理解病毒与寄主互作的意义

1．4 真菌病毒的传播

1．4．1 水平传播

1．4．2 垂直传播

1．4．3 人工转染

1．4．4 体外浸染

1．4．5 昆虫传播真菌病毒

1．5 真菌DNA病毒SsHADV-1

1．6 病毒、寄主及昆虫互作的研究

1．7 研究目的与思路

2．1 引言

2．2．1 菌株及培养

2．2．2 昆虫饲养与鉴定

2．2．3 SsHADV-1检测

2．2．4 SsHADV-1病毒粒子提取

2．2．5 Southern blot杂交

2．2．6 免疫荧光观察

2．2．7 SsHADV-1显微注射厉眼蕈蚊

2．2．8 厉眼蕈蚊获得SsHADV-1检测

2．3 结果与分析

2．3．1 昆虫取食与鉴定

2．3．2 厉眼蕈蚊幼虫体表粘附菌丝片段

2．3．3 厉眼蕈蚊幼虫获得SsHADV-1

2．3．4 SsHADV-1在厉眼蕈蚊体内表达分析

2．3．5 免疫荧光检测发现SsHADV-1存在于厉眼蕈蚊组织内

2．3．6 厉眼蕈蚊幼虫获得病毒最短时间检测

2．3．7 厉眼蕈蚊将SsHADV-1传给后代昆虫检测

2．4 讨论

第三章 SsHADV-1在草地螟夜蛾细胞内复制

3．1 引言

3．2 材料方法

3．2．1 菌株与细胞

3．2．2 Sf9细胞培养

3．2．3 病毒检测

3．2．4 Northern blot杂交

3．2．5 免疫荧光观察SsHADV-1侵染的Sf9细胞

3．2．6 流式细胞仪测定病毒侵染率

3．2．7 SsHADV-1在草地螟夜蛾细胞系(st9)中复制分析

3．2．8 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 SsHADV-1在Sf9细胞中复制

3．3．2 梯度稀释的SsHADV-1病毒粒子悬液侵染Sf9细胞

3．3．3 SsHADV-1侵染不同时间点的Sf9细胞侵染率

3．3．4 SsHADV-1侵染Sf9细胞的后代细胞

3．3．5 SsHADV-1侵染Sf9细胞后释放再侵染Sf9能力

3．3．6 从Sf9细胞释放出的SsHADV-1具有再侵染核盘菌的能力

3．4 讨论

第四章 厉眼蕈蚊传播SsHADV-1

4．1 引言

4．2．1 菌株及培养

4．2．2 SsHADV-1检测

4．2．3 Southern blot杂交

4．2．4 厉眼蕈蚊幼虫传播SsHADV-1检测

4．2．5 厉眼蕈蚊幼虫传播SsHADV-1所需最短时间测定

4．2．6 厉眼蕈蚊成虫在菌落上传播SsHADV-1检测

4．2．7 厉眼蕈蚊卵传播SsHADV-1检测

4．2．8 厉眼蕈蚊成虫在油菜上传播SsHADV-1检测

4．2．9 传毒菌株生物学特性分析

4．2．10 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 厉眼蕈蚊幼虫传播SsHADV-1

4．3．2 厉眼蕈蚊幼虫最短传毒时间检测

4．3．3 厉眼蕈蚊成虫在核盘菌菌落上传播SsHAV-1

4．3．4 厉眼蕈蚊卵传播SsHADV-1

4．3．5 厉眼蕈蚊成虫在油菜上传播SsHADV-1

4．3．6 厉眼蕈蚊传毒菌株表型观察

4．4 讨论

第五章 厉眼蕈蚊与SsHADV-1互惠性互作

5．1 引言

5．2．1 菌株及培养

5．2．2 厉眼蕈蚊成虫对菌株DT-8菌落产卵趋向性测定

5．2．3 “Y"形管测试厉眼蕈蚊成虫选择菌株DT-8菌落产卵的趋向性

5．2．4 核盘菌挥发物鉴定分析

5．2．5 “Y”形管测试蘑菇醇和辛酮对厉眼蕈蚊成虫的作用

5．2．6 核盘菌蘑菇醇和辛酮合成相关基因的表达分析

5．2．7 SsHADV-1对厉眼蕈蚊成虫怀卵量影响测定

5．2．8 数据分析

5．3 结果与分析

5．3．1 厉眼蕈蚊成虫趋向于菌株DT-8菌落产卵

5．3．2 厉眼蕈蚊成虫趋向于菌株DT-8产生的挥发性物质

5．3．3 核盘菌挥发物鉴定分析

5．3．4 蘑菇醇和辛酮对厉眼蕈蚊成虫具有显著的趋避作用

5．3．5 SsHADV-1侵染核盘菌后部分蘑菇醇和辛酮合成相关基因下调表达

5．3．6 SsHADV-1促进厉眼蕈蚊成虫产卵

5．4 讨论

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 油菜田厉眼蕈蚊观察

6．2．2 油菜田厉眼蕈蚊成虫携带SsHADV-1检测

6．2．3 油菜田厉眼蕈蚊可能携带的真菌病毒种类检测

6．3 结果与分析

6．3．2 油菜田检测厉眼蕈蚊成虫携带SsHADV-1

6．3．3 高通量测序检测厉眼蕈蚊携带的真菌病毒

6．4 讨论

7．1 全文总结与创新

7．2 全文展望

参考文献

论文发表

致谢