猪源肠外致病性大肠杆菌T6SS效应分子Rhs的功能及作用机制研究

摘要

细菌能运用多种机制有效地将蛋白运输到胞外，而其分泌的蛋白在细菌和宿主相互作用、细菌间的竞争以及细菌与环境对抗的过程中发挥着关键作用。目前，在革兰氏阴性菌中被报道存在6种主要的分泌系统(TypeⅠ-Ⅵ secretion system)。2006年TypeⅥ secretion system(T6SS)首次被报道于霍乱弧菌和铜绿假单胞菌中，与其致病性相关。T6SS作为一种蛋白分泌装置将效应蛋白直接注射到靶细中，其分泌的效应蛋白既能靶向原核生物也可以作用于真核生物。效应蛋白被T6SS识别和分泌主要有两种模式:与T6SS结构蛋白融合表达分泌出去;另一种方式则是与T6SS核心组件形成非共价键被携带出去。这两种分泌模式都与T6SS的Hcp-VgrG-PAAR管道结构密切相关。
　　Rhs(Rearrangement hotspot)作为细菌T6SS的效应蛋白，被报道在细菌的接触依赖性生长抑制过程中发挥重要作用。Rhs是一类分子量比较大的T6SS效应蛋白，由保守的N端、核心区以及多变的C端构成。Rhs基因的C端(RhsCT)是其毒性发挥的关键部位。Rhs的C端通常编码酶类蛋白或者穿孔素活性蛋白，以此作用于靶细胞的细胞壁、细胞膜以及细胞核，如:脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、脱氨酶、金属肽酶。在Rhs基因下游通常存在其免疫蛋白基因RhsI(Rhs Immunity Protein)，RhsI对Rhs所产生的毒性具有中和作用，以此避免细菌受到自身分泌的效应蛋白的破坏。
　　在本研究的猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033中，通过生物信息学分析，我们找到了四个经典的Rhs蛋白，并分别命名为Rhs1、Rhs2、Rhs3、Rhs4。其中Rhs2在T6SS基因簇内，位于T6SS基因vgrG2的下游;Rhs1、Rhs3、Rhs4在T6SS基因簇外部，Rhs1位于vgrG4基因下游。同时，我们发现Rhs1、Rhs2、Rhs3、Rhs4的N端都存在PAAR的结构。通过蛋白数据库比对，我们发现Rhs1的C端与穿孔素蛋白4oeb A具有一定的相似性，而Rhs2、Rhs3、Rhs4并未比对出结果。为此，我们展开了以下实验:
　　1基因缺失株⊿Rhs1 CT、⊿Rhs2CT、⊿Rhs3CT、⊿Rhs4CT的构建
　　以亲本菌株PCN033为模版扩增Rhs1CT、Rhs2CT、Rhs3CT、Rhs4CT基因上下游同源臂，将上下游同源臂串联连接在pRE112载体上，由此构建成重组载体pRE112-⊿Rhs1CT、pRE112-⊿Rhs2CT、 pRE112-⊿Rhs3CT、 pRE112-⊿Rhs4CT。将重组载体转化至大肠杆菌X7213感受态细胞中，以X7213为供体菌，亲本菌株为受体菌，通过接合转移的方法将重组质粒整合至亲本菌基因组中，由此获得单交换菌株。通过无盐LB培养基和蔗糖LB交替传代单交换菌株，筛选出对Cm敏感和蔗糖耐受菌株即为双交换菌株。用RhsCT基因的引物和外源引物鉴定双交换菌株。我们成功构建了⊿Rhs1CT、⊿Rhs2CT、⊿Rhs3CT、⊿Rhs4CT四个单基因缺失株。
　　2 RhsCT蛋白的原核表达及毒性研究
　　以PCN033基因组为模板扩增Rhs1CT、 Rhs2CT、 Rhs3CT、Rhs4CT基因全长，分别连接到pET-28a载体上，再转化至BL21菌株中。然后进行诱导表达条件的摸索，经过多个条件的摸索后，只有Rhs4CT表达在包涵体中，而Rhs1 CT、Rhs2CT和Rhs3CT都未表达。为此，我们将以上做表达的BL21菌株以及含空载体的BL21菌株重新复苏，OD600调成一致，经过倍比稀释后，分别蘸等量各个稀释度的菌液于K50平板和K50+IPTG平板上诱导过夜，我们发现相比于含空载体的BL21菌株，含Rhs1CT、Rhs2CT和Rhs3CT基因的BL21菌株在有诱导剂的平板上生长明显受到抑制，而含Rhs4CT基因的BL21菌株在有诱导剂的平板上生长不受影响。因此，我们认为Rhs1CT、Rhs2CT、Rhs3CT这三个蛋白对细菌的生长有很强的毒性作用。
　　3免疫蛋白RhsI的验证
　　细菌为了避免被自身分泌的效应蛋白伤害，通常细菌会同时表达能中和效应蛋白毒性的免疫蛋白。通过ORF finder，我们预测出Rhs1CT、Rhs2CT和Rhs3CT的免疫蛋白Rhs1I、Rhs2I、Rhs3I。然后将去掉终止密码子的RhsCT基因与RhsI基因融合连接到pET-28a将载体上。通过平板诱导实验，我们成功验证出效应蛋白Rhs2CT和Rhs3CT对应的免疫蛋白Rhs2I、Rhs3I。遗憾的是，由于效应蛋白与免疫蛋白相互作用的机制并不清楚，我们并未验证出对Rhs1CT有中和作用的Rhs1I。
　　4 RhsCT基因缺失株及野生株致病性研究
　　我们想从活体水平和细胞水平上论证RhsCT细菌致病中的作用。首先我们将缺失株与亲本株以同等剂量107的菌量静脉注射至小鼠体内，对血液、脑、肺、脾的载菌量计数比较后，我们发现相比于野生株，Rhs1CT基因缺失后，细菌在动物的血液、肺脏和脑部的定殖能力明显下降，而其他三个基因缺失株并没有明显差异。基于这一结果，我们又将野生株与⊿Rhs1CT以2×106腹腔注射至小鼠体内，记录小鼠的死亡率。结果表明，相比于野生株Rhs1CT基因被敲除后，细菌对小鼠的致死能力明显下降。
　　在体外37℃，5％CO2条件下，我们比较了细菌在吞噬细胞中存活能力以及细菌对上皮细胞粘附侵入能力。与野生株相比，⊿Rhs1CT在小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中吞噬后存活能力明显下降。同样，Rhs1CT基因缺失后，细菌对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的黏附和侵入能力也明显下降。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1．文献综述

1．1 六型分泌系统概述

1．1．1 六型分泌系统简介

1．1．2 T6SS效应分子介绍

1．1．3 作用于细菌的效应分子

1．1．4 作用于真核生物的效应分子

1．1．5 效应分子的组装和分泌模式

1．1．6 T6SS的效应蛋白与免疫蛋白研究状况

1．2 肠外致病性大肠杆菌中T6SS研究进展

1．3 Rhs基因研究进展

1．3．1 Rhs基因结构及分布

1．3．2 Rhs基因功能研究进展

2．研究目的与意义

3．材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 细胞及实验动物

3．1．3 工具酶及主要试剂、试剂盒及仪器

3．1．4 培养基与抗生素及其配制

3．1．5 主要缓冲液与相关溶液及其配制

3．1．6 使用引物

3．2 实验方法

3．2．1 大肠杆菌的复苏

3．2．2 猪源肠外致病性大肠杆菌基因组的提取

3．2．3 质粒小提

3．2．4 PCR产物和酶切产物的回收纯化

3．2．5 大肠杆菌X7213感受态制备(氯化钙法)

3．2．6 连接产物的转化

3．2．7 重组质粒的鉴定

3．2．8 重组自杀性质粒的构建

3．2．9 原核表达质粒的构建

3．2．10 RhsCT蛋白的原核表达及SDS-PAGE鉴定

3．2．11 RhsCT蛋白的毒性验证

3．2．12 RhsI蛋白对RhsCT蛋白的毒性中和作用验证

3．2．13 缺失株的构建及PCR鉴定

3．2．14 生长特性测定

3．2．15 吞噬后存活试验

3．2．16 粘附侵入能力试验

3．2．17小鼠感染试验

3．2．18 组织载菌量测定

3．2．19 使用生物学软件及网站

3．2．20 统计学分析

4．结果与分析

4．1 PCN033中Rhs基因分析

4．1．1 Rhs基因的确定

4．1．2 Rhs基因生物信息学分析

4．2 猪源肠外致病性大肠杆菌Rhs1CT、Rhs2CT、Rhs3CT、Rhs4CT的原核表达

4．2．1 pET-28a-RhsCT原核表达质粒的鉴定

4．2．2 Rhs1CT、Rhs2CT、Rhs3CT、Rhs4CT融合蛋白的表达

4．2．4 pET-28a-RhsCT-RhsI重组载体的构建

4．2．5 免疫蛋白Rhs2I、Rhs3I的验证

4．3．2 缺失株ΔRhs1CT、ΔRhs2CT、ΔRhs3CT、ΔRhs4CT的构建及鉴定

4．4 菌株生长特性测定

4．5．1 小鼠体内载菌量的比较

4．5．2 感染后死亡率的比较

4．6 吞噬后存活能力的比较

4．7 粘附侵入能力的比较

5．讨论

5．1 Rhs基因的确定

5．2 基因缺失突变株的构建

5．3 Rhs-CT基因的原核表达及抗菌毒性研究

5．4 免疫蛋白RhsI的验证

5．5 RhsCT基因致病能力分析

5．6 后续工作展望

6．结论

参考文献

致谢