论文说明
声明
摘要
缩略语表
1文献综述
1．1研究问题的由来
1．2大肠杆菌概述
1．2．1肠道致病性大肠杆菌
1．2．2肠外致病性大肠杆菌
1．3细菌分泌系统概述
1．3．1六型分泌系统简介
1．3．2六型分泌系统功能研究进展
1．3．3六型分泌系统效应因子研究进展
1．4 VgrG研究进展
1．4．1 VgrG蛋白结构研究进展
1．4．2 VgrG功能研究进展
1．5大肠杆菌中T6SS的研究进展
1．6分泌系统激活炎性体的研究进展
2研究目的与意义
3材料与方法
3．1实验材料
3．1．1菌株、质粒与细胞
3．1．2细胞及实验动物
3．1．3工具酶及主要试剂、试剂盒及仪器
3．1．4实验所用手术器械
3．1．5培养基与抗生素及其配制
3．1．6主要缓冲液与相关溶液及其配制
3．1．7使用引物
3．2实验方法
3．2．1猪源肠外致病性大肠杆菌的培养及基因组的提取
3．2．2细胞的传代及培养
3．2．3大肠杆菌感受态制备(氯化钙法)
3．2．4连接产物的转化
3．2．5质粒的制备与鉴定
3．2．6自杀性重组质粒的构建
3．2．7缺失株的筛选及鉴定
3．2．8生长特性测定
3．2．9细菌抗菌活性检测实验
3．2．10 LDH-cytotoxicity实验
3．2．11不同菌株与HBMEC细胞黏附侵入实验
3．2．12组织载菌量测定
3．2．13全血杀菌实验
3．2．14小鼠组织切片
3．2．15感染小鼠中炎性因子测定
3．2．16猪源肠外致病性大肠杆菌及其感染后细胞总RNA的提取
3．2．17 cDNA模板制备
3．2．18荧光定量PCR
3．2．19转录组测序及数据的分析
3．2．20细菌感染细胞后细胞样品的收集
3．2．21细胞样品中炎性因子的检测
3．2．22统计分析
4结果与分析
4．1 PCN033中六型分泌系统vgrG基因分析
4．1．1 PCN033中编码T6SS相关基因分析
4．1．2 T6SS中假定的VgrG氨基酸序列比对分析
4．1．3 T6SS中假定的VgrG氨基酸保守结构域分析
4．1．4 T6SS中假定的VgrG氨基酸保守gp27／gp5结构域标注
4．2．1双基因缺失株△vgrG1△0248、△vgrG2△1588和四基因缺失株△vgrG1△0248△vgrG2△1588的构建及鉴定
4．2．2双基因缺失菌株生长特性测定
4．2．3基因vgrG缺失后小鼠存活能力分析
4．2．4双基因缺失菌株抗菌活性能力分析
4．2．5双基因缺失株对HBMEC细胞黏附侵入能力的比较
4．2．6双基因缺失株LDH-cytotoxicity实验
4．2．7小鼠体内组织载菌量比较
4．2．8全血杀菌能力比较
4．3猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033六型分泌系统基因簇内vgrG基因的功能研究
4．3．1三基因缺失株和互补菌株的构建及鉴定
4．3．2三基因缺失菌株和互补株生长特性的测定
4．3．3 VgrG1和0248抗菌活性能力分析
4．3．4 VgrG1和0248对HBMEC细胞黏附侵入能力的分析
4．3．5 VgrG1和0248对PCN033在小鼠体内定殖能力的影响
4．3．6 VgrG1和0248对PCN033在全血中存活能力的影响
4．4 VgrG1和VgrG2功能差异原因的分析
4．4．2 VgrG1和VgrG2生物学功能分析
4．4．3转录水平分析
4．4．4 VgrG在PCN033 T6SS中扮演的角色
4．5 PCN033 T6SS潜在效应因子预测
4．6 PCN033 T6SS参与炎症反应
4．6．1 PCN033 T6SS缺失株感染细胞后样品转录组测序分析
4．6．2 PCN033感染宿主后引起炎症反应
4．6．3 PCN033感染细胞后激活NLRP3信号通路
4．6．4 T6SS缺失后降低PCN033激活的炎性反应
5讨论
5．1 T6SS基因簇内的VgrG1在PCN033的抗菌及致病过程中发挥重要作用
5．2 T6SS基因簇内的VgrG1促进PCN033抗菌及致病性
5．3 VgrG1可能作为T6SS的结构组分影响其活性
5．4 T6SS可通过激活NLRP3炎性小体促进PCN033的炎性反应
6结论
参考文献
附录
致谢
