猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4切割STAT2分子机制的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种给全世界的养猪业造成巨大损失的病毒性传染病。研究发现PRRSV通过自身编码的蛋白抑制机体的天然免疫应答，实现免疫逃避，但目前关于PRRSV编码的nsp4蛋白抑制JAK-STAT信号通路的分子机制有待进一步研究。
　　本研究通过研究PRRSV编码的nsp4与JAK-STAT信号通路之间的相互作用，发现nsp4能切割关键信号分子STAT2。进一步分析了nsp4切割STAT2的氨基酸位点，探讨nsp4切割STAT2在PRRSV调控天然免疫反应中的作用。主要内容如下:
　　1.PRRSV感染细胞后抑制ISGs的表达
　　通过相对荧光定量PCR检测发现PRRSV感染PAMs细胞和MARC-145细胞后显著抑制IFN-α诱导的2'，5'-OAS，ISG15，ISG56和ISG60的mRNA水平;双荧光素酶实验结果显示PRRSV感染MARC-145后可以显著抑制IFN-α对ISRE-Luc的激活。为筛选出抑制ISRE活性的蛋白，将PRRSV编码的所有结构蛋白和非结构蛋白的真核表达质粒与荧光素酶报告质粒ISRE-Luc和pGL-4.74共转染HEK-293T细胞，双荧光素酶实验结果显示PRRSV的非结构蛋白nsp1a、nsp1b、nsp4、nsp11、nsp12，结构蛋白GP3和N均能抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性，其中nsp4抑制效果显著。
　　2.PRRSV编码的nsp4蛋白依赖其丝氨酸蛋白酶活性抑制IFN-α诱导的ISRE活性
　　将真核表达质粒nsp4进行倍比稀释与荧光素酶报告质粒ISRE-Luc共转染HEK-293T或3D4细胞，双荧光素酶检测结果显示在这两种细胞上nsp4均能显著抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性，并且呈明显的剂量依赖;利用双荧光素酶报告系统证明nsp4抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性依赖其丝氨酸蛋白酶活性。
　　3.PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2位点为E719
　　本研究发现超表达nsp4对STAT2蛋白的mRNA水平没有影响，而切割JAK-STAT信号通路中关键蛋白STAT2，且呈明显的剂量依赖;本研究证明nsp4切割STAT2不依赖泛素-蛋白酶体途径和细胞凋亡途径，而是依赖于自身的丝氨酸蛋白酶活性，并鉴定出nsp4切割STAT2的位点为E719。PRRSV感染MARC-145细胞后，Western Blot检测发现内源性STAT2被降解，但是检测不到切割条带。
　　4.PRRSV编码的nsp4蛋白拮抗JAK-STAT信号通路
　　本研究将nsp4真核表达质粒与STAT1和STAT2真核表达质粒共转染HEK-293T细胞，通过Co-IP实验发现PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2之后，STAT1和STAT2的相互作用显著减弱。将STAT2全长或截短突变体与STAT1和IRF9共转染，双荧光素酶实验和荧光定量PCR结果显示只有全长STAT2可以与STAT1和IRF9作用激活ISRE，诱导ISGs表达，截短的STAT2不能激活ISRE活性和ISGs的表达，nsp4切割STAT2抑制了JAK-STAT信号通路的信号传递。
　　综上所述，本研究首次揭示了PRRSV编码的nsp4蛋白在拮抗JAK-STAT信号通路中的重要作用;发现PRRSV编码的nsp4蛋白依赖其自身的丝氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信号通路中重要信号分子STAT2蛋白，阻止信号向下游传递，抑制ISRE启动子活性，以及ISGs的转录表达。同时鉴定出nsp4切割STAT2的位点是E719。本研究加深了我们对PRRSV致病和免疫逃避机制的理解，为PRRSV疫苗研究与开发提供理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1．1 PRRSV的危害

1．1．2 PRRSV的分子生物学特征

1．1．3 nsp4蛋白简介

1．2 抗病毒免疫相关的信号通路

1．2．1 Toll样受体(TLRs)信号通路

1．2．2 RIG-I信号通路(RLRs)

1．2．3 JAK-STAT信号通路

1．3 3C样蛋白酶调控天然免疫

1．4 PRRSV调控天然免疫

1．4．1 PRRSV抑制干扰素的产生

1．4．2 PRRSV拮抗JAK-STAT信号通路

2 目的与意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 细胞、毒株和菌株

3．1．2 构建质粒所需材料

3．1．3 工具酶及主要试剂

3．1．4 Western Blot实验所需材料

3．1．5 培养基及相关试剂配制

3．1．6 主要缓冲液和试剂及其配制

3．1．7 主要实验仪器及设备

3．1．8 分子生物学分析软件

3．2 试验方法

3．2．1 细胞总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR

3．2．2 JAK-STAT信号通路5个接头分子真核表达质粒构建

3．2．3 STAT2突变体真核表达质粒构建

3．2．4 限制性内切酶酶切反应

3．2．5 PCR产物或酶切产物的电泳检测

3．2．6 PCR产物或酶切产物的回收与纯化

3．2．7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3．2．8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3．2．9 连接产物的转化

3．2．10 重组质粒的制备与鉴定

3．2．11 PAMs细胞制备

3．2．12 质粒转染(脂质体介导转染法)

3．2．13 双荧光素酶报告基因实验

3．2．14 Western Blot样品制备

3．2．15 Co-IP样品制备

3．2．16 统计学方法

4 结果与分析

4．2 筛选抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性的蛋白

4．3 PRRSV nsp4蛋白抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性

4．4 nsp4蛋白抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性依赖其丝氨酸蛋白酶活性

4．5 nsp4蛋白切割STAT2

4．5．2 超表达nsp4切割STAT2

4．5．3 nsp4蛋白丝氨酸蛋白酶活性影响其切割活性

4．5．4 PRRSV感染降解STAT2

4．6 nsp4蛋白切割STAT2位点的研究

4．7 nsp4蛋白切割STAT2对JAK-STAT信号通路的影响

4．7．1 nsp4蛋白切割STAT2影响STAT1与STAT2的互作

4．7．2 STAT2蛋白被nsp4切割之后，ISRE启动子活性被抑制

4．7．3 STAT2蛋白被nsp4切割之后，ISRE诱导的ISGs被抑制

5 讨论

5．2 PRRSV编码的nsp4蛋白抑制IFN-α诱导的ISRE活性的研究

5．3 PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2蛋白

5．4 PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2位点的鉴定

5．5 PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2的影响

6 结论

参考文献

致谢