猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp4切割ZAP的机制研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）主要引起母猪繁殖障碍，公猪精液质量下降，以及仔猪呼吸系统疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。PRRSV属于动脉炎病毒科，为单股正链、有囊膜的RNA病毒，基因组长度约为15kb。
　　在与病毒长期共存的过程中，宿主进化出一些抗病毒基因，这些抗病毒基因编码的蛋白，即宿主限制因子，可以抑制病毒的增殖。锌指抗病毒蛋白(Zinc finger antiviral protein，ZAP)是一种重要的宿主限制因子，存在两种剪接变异体(ZAP-L和ZAP-S)。以前的研究证实ZAP的两种剪接变异体对多种病毒具有抑制作用。目前，对猪源ZAP的研究较少，其能否抑制PRRSV的增殖也未见报道。鉴于此，本论文以PRRSV、猪源ZAP和PRRSV nsp4作为研究对象，探究ZAP是否能够抑制PRRSV的增殖及其抗病毒机制，同时探究PRRSV是否存在拮抗ZAP抗病毒作用的机制。主要研究内容如下:
　　1.超表达ZAP抑制PRRSV的增殖
　　克隆了猪源ZAP两种剪切变异体（ZAP-L和ZAP-S）的全长cDNA，并构建了真核表达质粒Flag-ZAP-L和Flag-ZAP-S。将其分别转染MARC-145细胞，转染24h后接种0.5MOI的PRRSV，在PRRSV感染24h后收样，通过Real-time PCR、TCID50、IFA以及Western blot检测超表达ZAP对PRRSV增殖的影响，结果表明超表达ZAP-L和ZAP-S均显著抑制PRRSV的增殖，并呈剂量依赖性。
　　2.ZAP不靶向PRRSV的5'UTR和3'UTR
　　以前的研究报道ZAP可以通过靶向病毒的5'UTR和3'UTR从RNA水平上抑制辛德毕斯病毒等病毒的增殖。为了探究ZAP是否靶向PRRSV的5'UTR和3'UTR，分别将PRRSV的5'UTR和3'UTR克隆到pGL3control载体上，然后将Flag-ZAP-L和Flag-ZAP-S以及空载体pCAGGS-Flag分别与pGL3control-PRRSV-5'UTR或pGL3control-PRRSV-3'UTR以及内参质粒pRL-TK共转染HEK-293T细胞，双荧光素酶活性检测结果表明ZAP不靶向PRRSV的5'UTR和3'UTR。
　　3.ZAP-L抑制PRRSV nsp7β，nsp9，nsp12的表达，而PRRSV nsp4能够切割ZAP
　　以前的研究报道ZAP-L还可以通过降解病毒的蛋白抑制流感病毒等病毒的增殖，为了探究ZAP-L能否通过同样的方式抑制PRRSV的增殖，将PRRSV非结构蛋白的真核表达质粒和Flag-ZAP-L共转染HEK-293T细胞，Western blot检测发现ZAP-L呈剂量依赖性抑制PRRSV非结构蛋白nsp7β，nsp9和nsp12的表达。同时我们还意外地发现PRRSV nsp4能够切割ZAP，并且PRRSV nsp4对ZAP的切割也呈剂量依赖性。
　　4.PRRSV nsp4对ZAP的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性
　　由于PRRSV nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶，具有切割活性，为了说明nsp4对ZAP的切割是否依赖其3C样蛋白酶活性，通过定点突变构建了其酶活突变体真核表达质粒(H39A，D64A，S118A)，将Flag-ZAP-L分别与PRRSV nsp4野生型及酶活突变体的真核表达质粒共转染HEK-293T细胞，Western blot检测发现PRRSVnsp4的酶活突变体不能切割ZAP，而野生型的nsp4可以切割ZAP，说明nsp4对ZAP的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。进一步利用泛素-蛋白酶体途径、细胞自噬溶酶体途径和细胞凋亡途径的抑制剂检测发现，PRRSV nsp4切割ZAP不依赖细胞自噬、凋亡及蛋白酶体途径。
　　5.PRRSV nsp4识别ZAP第411位谷氨酸，且切割ZAP产生片段的抗病毒作用显著减弱
　　根据PRRSV nsp4识别底物P1位氨基酸的特点及其切割ZAP产生片段的大小，推测其切割ZAP的潜在位点有六个:E288，E329A，E334A，E371A，E411A，E453A。为了确定PRRSV nsp4切割ZAP的位点，通过定点突变构建了ZAP-L突变体的真核表达质粒(E288A，E329A，E334A，E371A，E411A，E453A)，将其与野生型ZAP-L的真核表达质粒分别与PRRSV nsp4的真核表达质粒共转染HEK-293T细胞，Western blot检测发现除了突变体E411不被切割外，其他几个突变体和野生型ZAP-L均被切割，说明PRRSV nsp4识别ZAP第411位谷氨酸。为了进一步探讨PRRSV nsp4切割ZAP的生物学意义，构建了ZAP-L被切割后产生的片段ZAP(1-411)和L(412-895)以及ZAP-S被切割后产生的C端片段S(412-779)的真核表达质粒，并与全长ZAP-L或者ZAP-S的抗PRRSV活性进行比较。结果发现，相对于全长ZAP-L或者ZAP-S，被切割片段抑制PRRSV增殖的能力显著减弱，表明PRRSV nsp4通过切割ZAP致弱其抗病毒活性。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 猪繁殖与呼吸综合征

1．1．1 PRRSV的概述

1．1．2 PRRSV的分子生物学简介

1．2 PARP家族蛋白以及ZAP概述

1．2．1 PARP家族蛋白概述

1．2．2 ZAP的概述

1．2．3 ZAP的抗病毒机制

1．2．4 病毒拮抗ZAP的机制

第2章 研究目的和意义

3．1．1 细胞、菌株

3．1．2 载体与质粒

3．1．3 工具酶及主要试剂

3．1．4 Western blot所需材料

3．1．5 培养基及其配制

3．1．6 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3．1．7 主要实验仪器及设备

3．1．8 分子生物学分析软件

3．2 试验方法

3．2．1 猪源ZAP及其突变体的构建

3．2．2 PRRSV的增殖

3．2．3 病毒滴度的测定

3．2．4 细胞样品总RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR

3．2．5 PCR产物或酶切产物的电泳检测

3．2．6 PCR产物或酶切产物的回收与纯化

3．2．7 限制性内切酶酶切反应

3．2．8 外源I)NA片段与质粒载体的连接反应

3．2．9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3．2．10 连接产物的转化

3．2．11 重组质粒的制备与鉴定

3．2．12 质粒的转染(脂质体介导的瞬时转染法)

3．2．13 双荧光素酶检测实验

3．2．14 Western blot

3．2．15 间接免疫荧光检测蛋白质的亚细胞定位

3．2．16 统计学方法

第4章 结果与分析

4．1 猪源ZAP真核表达质粒的构建

4．2 超表达ZAP抑制PRRSV的增殖

4．3 ZAP不靶向PRRSV的5’UTR和3’UTR

4．4 ZAP-L抑制PRRSV nsp7β、nsp9、nsp12的表达，PRRSV nsp4切割ZAP-L

4．5 PRRSV nsp4切割ZAP呈剂量依赖性

4．6 PRRSV nsp4切割ZAP依赖其蛋白酶活性

4．7 PRRSV nsp4切割ZAP的位点位于ZAP的第411位谷氨酸

4．8 PRRSV nsp4切割ZAP产生的片段的抗病毒作用显著减弱

第5章 讨论与结论

5．1 讨论

5．1．1 猪源ZAP对PRRSV增殖影响的研究

5．1．2 猪源ZAP抑制PRRSV增殖机制的探索

5．1．3 PRRSV nsp4拮抗ZAP的抗病毒机制

5．1．4 PRRSV nsp4切割ZAP位点的鉴定

5．2 结论

参考文献

致谢