三个花青素合成与调控基因转化甘蓝型油菜研究

摘要

油菜是世界四大油料作物之一，其成规模的种植产生的“花海”景观被作为重要的旅游观光资源进行开发利用。但天然油菜中花色以金黄为主，色调单一，使其开发受到一定程度的限制。植物花瓣颜色主要由类胡萝卜素、花青素和甜菜色素产生。类胡萝卜素可以产生黄色到橙红色花，而花青素可以产生红色到紫色和蓝色等更广泛的花色变异。油菜的黄色花为花瓣中类胡萝卜素累积所致，但油菜花瓣缺少花青素的合成与累积。前人的研究表明，甘蓝型油菜具有花青素合成途径的一整套合成与调控基因，但是这些基因大部分不在花瓣中表达，包括花青素合成关键酶基因ANS，DFR和调控基因PAP2，TT8和GL3。本研究构建了油菜花瓣特异性启动子XY355驱动的DFR，TT8和GL3表达载体，并通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜Westar。
　　本研究主要内容包括：⑴通过PCR扩增从甘蓝型油菜Westar中获得DFR全长cDNA序列，从白菜（洪山菜薹）中获得TT8和GL3全长cDNA序列，通过双酶切法以改造的P2301质粒为骨架构建表达载体。⑵通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜Westar，共获得了带有花瓣特异性启动子的DFR载体转化植物27株，TT823株，GL326株，经PCR检测为阳性的分别有14，18株和17株。⑶提取了5株DFR阳性植株花瓣总RNA，逆转录后进行荧光定量PCR分析。结果表明至少有2株花瓣中的DFR表达量显著上升，而对照植株和其他转基因阳性植株DFR基本不表达。⑷分别收集对照植株（野生型）、转基因阳性但DFR未表达植株和转基因阳性DFR大量表达植株新鲜花瓣，提取花瓣的主要代谢物后利用UPLC-QTOF-MS技术进行代谢物组分分析。结果表明，代谢物组分的聚类分析可以将上述三类植株区分开来，但在分组比较中，未发现不同类别植株中存在代谢物组分的显著差别。

目录

声明

缩略表

1. 前言

1.1 油菜花的观赏价值

1.2 花青素代谢通路

1.3影响花青素累积的关键基因以及颜色形成的因素

1.4 利用基因工程技术改变花色的可行性

1.5 本研究的目的与意义

2. 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法与步骤

3. 结果与分析

3.1 pCAMBIA2301载体的改造

3.2 DFR、TT8、GL3花瓣特异性启动子载体的构建

3.3 农杆菌介导的遗传转化

3.4 转基因植株分子生物学鉴定

3.5 转基因植株表型观察

3.6转基因植株DFR基因表达量检测

3.7 转基因植株代谢物检测

4. 讨 论

参考文献

附录2. 各基因序列

附录3. 实验试剂配置方法

附录4. 实验室常用培养基配置

附录5. 农杆菌转化体系培养基配置

附录6. 第1-25分钟代谢产物对比分析图

致谢