表达鸭坦布苏病毒主要抗原的重组杆状病毒的构建及免疫原性分析

摘要

2010年我国开始爆发了严重的鸭坦布苏病毒病，主要感染了以水禽为主的禽类，受到影响最大的是产蛋鸭，造成产蛋鸭的产蛋量急剧下降甚至终止，部分鸭发生死亡。该病除了感染蛋鸭，也能感染其它禽类或鸟类，如鸡，鹅，麻雀等。这种病毒感染范围广，可以导致肉禽和蛋禽的感染，水禽比鸡的感染性更高，感染蛋、种禽发病率甚至达到100％，产蛋由高峰期的95%左右下降5%左右,继发感染时死亡率高达30%。鸭坦布苏病毒导致的免疫抑制也会增加继发感染的可能，对蛋鸭的养殖具有较大的威胁，在2010年为我国的养鸭业带来了巨大的损失。同时，有研究表明在养鸭场人员血清内检测到该病毒阳性，提示该病毒可能感染人类。坦布苏病毒的基因组具有典型的黄病毒基因组特点，其核酸为单股正链RNA病毒，基因全长10990bp，基因组由7个非结构基因和3个结构基因组成，编码的结构蛋白包括C、M、E蛋白，C蛋白为衣壳蛋白，M蛋白为膜蛋白，E蛋白为囊膜蛋白，有研究证实黄病毒前体膜蛋白prM可促进保护性免疫力的诱导产生，对E蛋白的结构稳定性也具有重要意义。大量对黄病毒的研究表明，囊膜蛋白E蛋白具有比较好的保守性和免疫原性，常作为亚单位疫苗或基因工程疫苗的首选基因。
　　本研究主要内容包括：⑴利用大肠杆菌表达系统分别表达并纯化PrM和E蛋白，将蛋白按照方法中的程序分三次免疫白兔，分离血清得到高效价的PrM和E多克隆抗体。⑵利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将鸭坦布苏prM-E基因及其信号肽序列克隆至杆状病毒基因组，得到rBac-prM-E，将rBac-prM-E转染sf9细胞，待细胞病变后收获重组杆状病毒AC-prM-E。⑶将感染了AC-prM-E的sf9细胞培养上清和细胞内的prM-E病毒样颗粒分别通过蔗糖梯度离心进行纯化后，与佐剂混合制备成亚单位疫苗，免疫樱桃谷鸭，结果表明该疫苗可以诱导机体产生针对E抗原的特异性抗体。⑷将感染了AC-prM-E的sf9细胞裂解后，离心收集上清，与佐剂混合制备成亚单位疫苗免疫产蛋麻鸭，并在免疫后28天利用鸭坦布苏DF2株攻毒，结果对照组卵巢发生破裂，萎缩。免疫一组和免疫二组中分别有2或3只蛋鸭卵巢未发生明显病变，统计本次实验中该疫苗攻毒保护率为40%或60%。⑸表达鸭坦布苏E基因EIII结构域的重组杆状病毒AC-2EIII的构建和初步验证。构建了表达鸭坦布苏病毒主要抗原区域EIII的重组杆状病毒AC-2EIII，结果表明EIII蛋白在sf9细胞内和培养基上清中呈可溶性表达。

目录

声明

缩略词（Abbreviation）

1. 前言

1.1 鸭坦布苏病毒简介

1.1.1鸭坦布苏病毒分子生物学

1.1.2鸭坦布苏病毒流行病毒学

1.1.3鸭坦布苏病毒进化分析

1.1.4鸭坦布苏病毒病原学

1.1.5鸭坦布苏病诊断与疫苗研发现状

1.2 杆状病毒表达系统综述

1.3 蛋白疫苗研究

2 研究目的和意义

3.1.1 细胞系

3.1.2病毒

3.1.3 菌种

3.1.4质粒

3.1.5 主要药品和试剂

3.1.6 主要试剂的配制

3.1.7 抗体

3.1.8实验动物

3.1.9 PCR引物

3.2方法

3.2.1 病毒的增殖及EID50的测定

3.2.2 RNA的提取和反转录

3.2.3 PCR产物或酶切产物的回收与纯化

3.2.4 DNA片段与质粒载体的连接反应

3.2.5 感受态的制备和产物的转化

3.2.6菌液PCR鉴定与测序

3.2.7质粒的制备与鉴定

3.2.8重组穿梭载体（Bacmid）的构建

3.2.9重组穿梭载体（Bacmid）的提取

3.2.10 sf9细胞的复苏，传代，冻存

3.2.11 Bacmid转染

3.2.12重组杆状病毒的滴度测定

3.2.13 SDS-PAGE电泳

3.2.14 Western blot试验

3.2.15 间接免疫荧光试验（IFA）

3.2.16蔗糖梯度离心和负染

3.2.17 亚单位疫苗的制备

3.2.18 E-ELISA 试验

3.2.19动物试验

3.2.20多克隆抗体制备

3.2.21多克隆抗体免疫样品制备和免疫方式

3.2.22组织切片

3.2.23统计学方法

4. 结果与分析

4.1鸭坦布苏prM和E多克隆抗体的制备及验证

4.1.1鸭坦布苏E基因的克隆以及重组表达质粒的构建

4.1.2 prM和E基因蛋白原核表达与纯化的鉴定

4.2 重组杆状病毒的构建和初步研究

4.2.1 AC-gp64-2EIII 的构建和表达验证

4.2.2 AC-VSV/G-prME的构建和表达验证

4.3基于杆状病毒表达系统的鸭坦布苏病毒亚单位疫苗AC-prME的制备及应用

4.3.1重组杆状病毒AC-prME的构建

4.3.2 Western blotting检测目的蛋白sf9细胞和上清中的表达

4.3.3间接免疫荧光实验（IFA）检测目的蛋白的体外表达

4.3.4 prM-E 蛋白在sf9细胞中形成鸭坦布苏病毒样颗的观察

4.3.5利用蔗糖梯度离心纯化sf9细胞中鸭坦布苏病毒样颗粒

4.3.6重组杆状病毒Ac-prME制备的亚单位疫苗

4.3.7 免疫后抗体检测

4.3.8免疫后攻毒结果

4.3.9病理切片结果分析

5讨论

5.1 本研究中主要抗原基因prM-E的选择和重组杆状病毒的构建方式的确定

5.2 动物实验策略的制定

5.3 提高抗原产量和免疫保护力的思考

5.4杆状病毒表达系统的应用、问题和展望

6结论

参考文献

致谢