香菇木质纤维素降解酶在不同碳源上的表达模式分析

摘要

香菇Lentinula edodes是一种味道鲜美、营养丰富的食用菌。我国是香菇主产国，占世界85％以上的产量，主要以阔叶木栓皮栎Quercus variabilis为原料进行栽培。香菇目前的栽培模式需要消耗大量森林资源，对环境造成威胁。人们对香菇木质纤维素的降解机制缺乏深入研究，这制约了基质转化效率的提高和非木质基质的开发利用。本实验室已完成香菇基因组测序和分析，为香菇木质纤维素降解机制的研究提供了基础平台。本课题在此平台基础上，利用转录组以及分泌蛋白组分析技术，初步探索了香菇对木质纤维素的降解模式。
　　1.通过比较香菇菌丝在葡萄糖、纤维素和纤维素+木质素磺酸钠（纤维素+SLS）3种培养基产生的分泌蛋白，分析了香菇木质纤维素降解酶的表达模式。采用nanoLC-MS/MS对分泌蛋白进行测序并鉴定，在上述3种培养基中总共鉴定到230个蛋白。Label-free蛋白半定量分析显示，在纤维素和纤维素+SLS培养基中大量表达的与植物细胞壁多糖降解相关的CAZy酶包括内切-β-1，4-葡聚糖酶(GH12)、α-半乳糖苷酶(GH27)、多聚半乳糖醛酸酶(GH28)和淀粉酶(GH15)。而在葡萄糖培养基中大量表达的是与木质素降解相关的酶，漆酶1的相对表达量最高(13.13％)。对香菇在纤维素培养基与纤维素+SLS培养基的分泌蛋白组比较分析发现，后者中纤维素酶和半纤维素酶的相对表达量高于前者，胞外酶活性分析也验证此结果。另外，qRT-PCR分析表明，在纤维素+SLS培养基中，纤维素酶和半纤维素酶基因的表达水平显著提高（32.2-到1166.7-fold）。结果表明香菇能够分泌降解木质纤维素的完整的胞外酶系;在培养基中添加SLS能够提高纤维素酶编码基因和半纤维素酶基因的表达。
　　2.通过香菇在木质和非木质生物质中分泌蛋白组比较，初步分析香菇菌丝对几种天然生物质的降解机制。以栎木屑（木质），柠条、稻秆、玉米秆、油菜杆、玉米芯和棉籽壳（非木质）为主要碳源，培养香菇菌丝，采用nanoLC-MS/MS对香菇菌丝在7种不同培养基中的分泌蛋白进行分析，共鉴定到154个不同蛋白。在稻秆培养基中分泌蛋白最少78个，而在其它培养基中分泌蛋白均超过100个。在7个分泌蛋白组中共同鉴定到的44个蛋白中，CAZy蛋白占70.5％，主要参与植物细胞壁多糖降解，这表明香菇对木质与非木质基质的细胞壁多糖降解具有广泛适应性。在香菇木质素降解酶中，漆酶（LACC13、LACC14、LACC12和LACC9）、class-Ⅱ过氧化物酶MnP和乙二醛氧化酶（AA5）在栎木屑培养基中大量表达，而在柠条、稻秆、玉米秆、油菜杆、玉米芯和棉籽壳等其它非木质培养基中少量表达或不表达，表明香菇木质素降解酶系统对木材木质素有独特的适应性。但是在非木质培养基中发现CDH或芳香物过氧化酶的大量表达，表明香菇中存在其它的策略降解非木质生物质的木质素。
　　3.香菇木质纤维素降解酶编码基因在葡萄糖、纤维素和纤维素+SLS诱导下的转录组分析。将香菇菌丝分别转移至葡萄糖、纤维素和纤维素+SLS培养基培养5d(简称为G5d、C5d和CL5d)，进行了转录组比较分析，结果显示约94％的CAZy基因在C5d或CL5d上调表达，并且发现在5个差异表达的转录因子基因中有4个是在CL5d上调或下调，表明SLS调控CAZy基因的表达。同时发现GH6和GH7的编码基因在C5d和CL5d中大量表达，基于GH6和GH7蛋白序列的系统发育分析表明这两个家族蛋白具有保守性，且香菇与多孔菌(Polyporus)亲缘关系更近。另外，在CL5d中上调表达的非CAZy基因中包含其它与木质素降解相关的酶细胞色素P450单加氧酶、脂肪酸代谢相关酶，表明木质素降解与多个代谢过程有关。
　　4.比较转录组分析香菇对葡萄糖和纤维素的初始应答机制。将香菇菌丝分别转移至葡萄糖（可直接利用碳源）和纤维素（不可直接利用碳源）培养基中短时(0.5h和2h)培养(简称为G0.5h、G2h和C0.5h、C2h)，然后进行了转录组分析比较。对葡萄糖和纤维素特异性诱导差异表达基因进行KOG富集分析，结果表明在0.5h的短时刺激下，特异性响应葡萄糖和纤维素的基因种类较多，分布于多个KOG class中;在2h时，特异性响应葡萄糖的基因功能集中在初级代谢和次级代谢过程中，特异性响应纤维素的基因功能主要集中于细胞过程和信号转导。对各个KOG class中的基因进行具体分析，发现在C0.5h中大多数KOG class下调表达的基因数量远多于上调基因，而在C2h中上调表达基因多于下调基因。
　　综上所述，香菇不仅能够分泌降解木质纤维素的完整的胞外酶系，而且在培养基中添加木质素磺酸钠时能提高纤维素酶基因和半纤维素酶基因的表达量。香菇对木质与非木质基质的多糖降解具有广泛适应性，木质素降解酶系统对木材木质素有独特的适应性，但同时存在其它的策略降解非木质生物质的木质素。转录组分析表明，木质素磺酸钠能够调控CAZy基因的表达;在2h短时刺激下特异性响应葡萄糖的基因集中在初级代谢和次级代谢途径中，而特异性响应纤维素的基因主要集中于细胞过程和信号转导。
　　通过以上研究探索香菇对木质纤维的利用机制，有利于根据香菇降解适应性开发新型基质及配方优化，辅助育种筛选对木质纤维素降解能力强的香菇菌株，在分子水平上改良香菇菌株用于生物转化或酶制剂生产。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1．1 植物木质纤维素多样性

1．1．2 木质纤维素降解酶的多样性

1．2 木质纤维素降解机制的组学研究概况

1．2．1 比较基因组学揭示真菌降解模式多样性

1．2．2 转录组和分泌蛋白组揭示真菌对木质纤维素的降解策略

1．3 真菌对碳源的感知和信号转导分子机制

1．3．1 真菌对胞外葡萄糖的感知

1．3．2 胞内营养信号转导

1．4 香菇的相关研究进展

1．4．1 香菇中木质纤维素降解酶研究进展

1．4．2 香菇子实体采收后的生物降解和代谢

1．4．3 香菇木料栽培到农业废弃物栽培的可行性分析

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．2．1 供试培养基配制

2．2．3 菌丝转移培养试验

2．3 胞外蛋白的提取

2．4 蛋白质样品浓度测定

2．5 蛋白质样品SDS-PAGE检测

2．6 蛋白质样品的纯化和消化处理

2．6．1 Readyprep 2-D Cleanup kit试剂盒纯化法

2．6．2 SDS-PAGE纯化法

2．6．3 蛋白样品胶内消化

2．7 LC-MS／MS和数据分析

2．8 胞外酶活分析

2．9 qRT-PCR分析

2．9．1 RNA提取和检测

2．9．2 第一链cDNA合成

2．9．3 引物设计

2．9．4 qRT-PCR分析

2．10 链特异性RNA文库构建及测序

2．11 RNA测序原始数据处理

2．12 基因差异表达分析

2．12．1香菇在葡萄糖和纤维素培养基中基因特异性表达分析

2．12．2香菇在葡萄糖和纤维素培养基中特异性表达基因的KOG富集分析

2．13 基于GH6和GH7家族蛋白序列的系统发育分析

3 结果与分析

3．1 香菇在葡萄糖，纤维素和纤维素+SLS培养基中分泌蛋白组的比较分析

3．1．1 香菇菌丝在不同培养基中的菌落形态及菌丝长速

3．1．2 香菇在葡萄糖，纤维素和纤维素+SLS培养基中的蛋白表达谱

3．1．3 香菇分泌蛋白组中与植物细胞壁降解相关蛋白的表达丰度

3．1．4 几种胞外酶的活性分析

3．1．5 纤维素酶和半纤维素酶编码基因的qRT-PCR分析

3．2 香菇在木质和非木质生物质培养基中分泌蛋白组比较分析

3．2．1 香菇在7种培养基中菌落形态观察和SDS-PAGE图谱多样性分析

3．2．2 香菇在7种培养基中分泌蛋白的多样性

3．2．3 香菇7个分泌蛋白组功能分类

3．2．4 香菇7个分泌蛋白组中主要蛋白类型的蛋白丰度差异性

3．2．5 香菇7个分泌蛋白组单个蛋白的表达差异性分析

3．2．6 香菇10个主要植物细胞壁多糖降解酶在7个分泌蛋白组中的表达模式

3．2．7 香菇10个主要木质素降解酶在7个分泌蛋白组中的表达模式

3．3 香菇木质纤维素降解酶基因在葡萄糖，纤维素和纤维素+SLS培养基中的转录组比较分析

3．3．1 香菇转录组数据统计分析

3．3．2 G5d，C5d和CL5d转录组差异基因表达分析

3．3．3 CAZy基因差异表达分析

3．3．4 Non-CAZy基因差异表达分析

3．3．5 差异表达的转录因子分析

3．3．6 qRT-PCR与转录组相互验证

3．3．7 基于GH6和GH7家族蛋白序列的系统发育分析

3．4 比较转录组分析香菇对葡萄糖和纤维素的初始应答机制

3．4．1 香菇CAZy酶和Zn(Ⅱ)2Cys6型转录因子基因qRT-PCR分析

3．4．2 RNA测序数据分析

3．4．3 香菇在纤维素和葡萄糖培养基中差异表达基因分析

3．4．4 香菇在葡萄糖和纤维素培养基中基因特异性表达分析

3．4．5 香菇在葡萄糖和纤维素培养基中特异性表达基因的KOG富集分析

4 讨论

4．1 香菇在葡萄糖，纤维素和纤维素+SLS培养基中木质纤维素降解酶的表达模式

4．1．1 香菇分泌蛋白组中的木质素降解酶表达模式

4．1．2 香菇分泌蛋白组中的植物多糖降解酶表达模式

4．2 香菇在木质和非木质生物质培养基中木质纤维素降解酶的表达模式

4．2．1 香菇在7种培养基中分泌蛋白组的整体分析

4．2．2 香菇对木材木质素具有独特的酶解适应性

4．2．3 香菇对木质和非木质基质中多糖具有广泛的酶解适应性

4．2．4 香菇非木质纤维素降解酶的表达

4．3 香菇在葡萄糖，纤维素和纤维素+SLS培养基中的基因表达模式

4．3．1 CAZy基因表达

4．3．2 non-CAZy基因表达

4．3．3 差异表达的转录因子

4．4 香菇对葡萄糖和纤维素初始应答机制推测

5 小结与展望

参考文献

附录

致谢