香菇木质素降解酶基因在不同基质中表达差异及lcc12和glox基因功能分析

摘要

香菇(Lentmula edodes(Berk.Pegler))是世界上最主要的人工栽培食用菌之一。目前主要栽培原料是栎木屑，基质转化率偏低，林木资源消耗量较大，而农作物秸秆还无法大量替代栎木屑进行香菇栽培。前期研究中发现，香菇栽培菌株武香一号W1中6个木质素降解酶与稻草基质降解能力相关，包括4个漆酶(LCC9，LCC12，LCC13，LCC14)，1个锰过氧化物酶(MNP2)和1个乙二醛氧化酶(GLOX)。本课题开展了香菇木质素降解酶基因在栎木屑和稻草两种基质中的表达模式分析，并对木质素降解酶基因lcc12和glox的功能进行了分析。
　　采用荧光定量PCR检测了38个香菇核心种质（包括22个野生菌株，16个栽培菌株）6个木质素降解酶基因在栎木屑和稻草基质中的表达水平。结果表明，野生菌株6个木质素降解酶基因在稻草基质中的表达量普遍高于栎木屑。3个野生菌株(Y1，Y78，Y94)各有4个木质素降解酶基因(Y1(glox，lcc12，lcc13和lcc14);Y78(lcc9,lcc12,lcc13和lcc14);Y94(lcc9,lcc13,lcc14和mnp2)）在稻草基质中表达量高于栎木屑5倍以上。栽培菌株中，仅菌株Z10的glox，lcc13和lcc143个木质素降解酶基因在稻草基质中表达量高于栎木屑5倍以上。相关性分析表明，mnp2基因表达均与漆酶基因之间具有显著相关性，且4个漆酶基因（lcc9，lcc12，lcc13和lcc14）之间也具有显著相关性。
　　构建了p1300-g-lcc12和p1300-g-glox的过表达载体，通过农杆菌介导的转化方法，将过表达载体转入到香菇菌株W1的双核菌丝中，分别挑取了5个lcc12的转化子和6个glox的转化子，并将转化子命名为lcc12-A1，lcc12-A4，glox-B3，glox-B4等，进行荧光定量PCR分析，结果表明lcc12-A1和lcc12-A4中lcc12基因表达量分别为野生型菌株W1的3.75倍和1.97倍，其它3个转化子基因表达量没有明显变化。glox-B3和glox-B4中glox基因表达量较野生型分别下调了13.69倍和4.14倍，其它4个转化子下调了2倍以下。
　　在CYM培养基、栎木屑和稻草3种基质中，分别测定了lcc12-A1，lcc12-A4，glox-B3，glox-B4的漆酶活性，及glox-B3和glox-B4的锰过氧化物酶活性。结果显示，在CYM和栎木屑基质中4个转化子漆酶活性与野生型菌株均无显著性差异，在稻草基质中，lcc12-A4漆酶活性较野生型菌株超出60％;在CYM和稻草基质中，glox-B3和glox-B4锰过氧化物酶活性与野生型菌株没有显著差异，在栎木屑基质中，glox-B3锰过氧化物酶活性显著高于野生型菌株。在栎木屑基质中4个转化子栽培试验表明，lcc12-A4在单袋菇数，单袋产量，单菇重等方面都显著优于野生型菌株。
　　本研究对进一步选育适宜于稻草基质栽培的香菇优良新品种，提高栎木屑基质的转化利用效率，揭示香菇木质素降解酶基因表达与调控规律具有重要意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 香菇概述

1．1．1 香菇生物学特性

1．1．2 香菇的食用价值和药用价值

1．1．3 香菇核心种质

1．1．4 香菇栽培史及栽培模式

1．2 农作物秸秆及其在食用菌产业中的应用

1．2．1 我国农作物秸秆概况

1．2．2 农作物秸秆在食用菌栽培中的应用

1．3 木质素简介

1．4 木质素降解酶

1．4．1 木质素降解酶的作用机理

1．4．2 木质素降解酶在食用菌中的应用研究

1．5 课题的研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 木质素降解酶

2．1．3 供试培养基配制

2．1．4 细菌菌株

2．1．5 质粒

2．1．6 试剂

2．2 香菇木质素降解酶基因在不同基质中的表达模式分析

2．2．1 核心种质菌丝培养及性状测定

2．2．2 核心种质RNA的提取与检测

2．2．3 第一链cDNA的合成

2．2．4 引物合成

2．2．5 qRT-PCR分析

2．2．6 数据统计与分析

2．3．2 重组质粒p1300-g-lcc12和p1300-g-glox的构建

2．3．3 农杆菌介导的香菇异核菌丝的转化

2．3．4 香菇转化子的鉴定

2．3．5 转化子菌丝体性状测定

2．3．6 转化子漆酶和锰过氧化物酶活性测定

2．3．7 转化子子实体农艺性状分析

3 结果与分析

3．1 核心种质木质素降解酶基因在木屑和稻草中表达水平分析

3．1．1 核心种质菌丝总RNA的提取及反转录

3．1．3 6个木质素降解酶基因在木屑和稻草基质中表达水平的分析

3．1．4 同一基质中菌丝长速与基因表达的相关性分析

3．1．5 同一基质中6个木质素降解酶基因表达的相关性分析

3．2 香菇木质素降解酶基因lcc12和glox的功能分析

3．2．1 目的基因条带扩增

3．2．2 p1300-g-lcc12／glox克隆载体的鉴定

3．2．3 香菇lcc12和glox转化子的筛选

3．2．4 转化子的PCR鉴定

3．2．5 转化子基因表达量的测定

3．2．6 lcc12和glox转化子菌丝生长速度分析

3．2．7 lcc12和glox转化子漆酶和锰过氧化物酶酶活分析

3．2．8 lcc12和glox转化子子实体阶段农艺性状分析

4 讨论

4．1 关于香菇木质素降解酶基因在稻草和木屑基质中的表达差异问题

4．2 关于香菇漆酶和锰过氧化物酶协同表达的问题

4．3 关于香菇木质素降解酶基因结构及表达量的问题

4．4 香菇木质素降解酶基因转化子表型分析

4．5 木质素降解酶功能与香菇新型基质开发

参考文献

致谢

附录